Neural Stem Cell Transplantation em Experimental contusão Model of Spinal Cord Injury
Summary
A lesão medular é uma condição traumática que causa grave morbidade e mortalidade elevada. Neste trabalho, descrever em detalhes um modelo contusão de lesão medular em ratos, seguido por um transplante de células-tronco neurais.
Abstract
A lesão medular é uma condição clínica devastadora, caracterizada por um complexo de disfunções neurológicas. Os modelos animais de lesão da medula espinal pode ser utilizado tanto para investigar as respostas biológicas a lesões e para testar terapias potenciais. Contusão ou compressão lesão entregue à medula espinal exposta cirurgicamente são os modelos mais amplamente utilizados de patologia. Neste relatório, a contusão experimental é realizada utilizando o dispositivo Impactor Infinito Horizon (IH), que permite a criação de um modelo animal lesão reprodutível através da definição de parâmetros de lesão específica. O transplante de células-tronco é comumente considerado uma estratégia potencialmente útil para a cura desta doença debilitante. Numerosos estudos têm avaliado os efeitos do transplante de uma variedade de células estaminais. Aqui demonstramos um método adaptado para lesão da medula espinal, seguido por injecção na veia da cauda de células em ratos CD1. Em suma, nós fornecemos procedimentos para: i) marcação celular with um traçador vital, ii) o atendimento pré-operatório de ratos, iii) execução de uma lesão medular contundente, e iv) a administração intravenosa de pós mortem precursores neurais. Este modelo de contusão pode ser utilizado para avaliar a eficácia e segurança de transplante de células estaminais em uma abordagem de medicina regenerativa.
Introduction
A lesão medular (LM) é a lesão mais comum causada por trauma de alta energia, como veículos automóveis acidentes, quedas, esportes e violência 1. Em grave SCI, a força lesão destrói ou danifica o tecido neural, causando perda súbita da função neurológica. Traumatic SCI ocorre frequentemente em adultos jovens entre 10 e 40 anos de idade. Ela afeta grandemente condição mental e física do paciente e causa enorme impacto econômico para a sociedade 2. A abordagem de tratamento na fase aguda é geralmente limitada a uma alta dose de corticosteróide, a estabilização cirúrgica e descompressão para possivelmente atenuar danos maiores 3-4, mas os papéis desses métodos na recuperação locomotora após SCI ainda são controversos. Além da perda de tecido aguda, lesão traumática e a activação de mecanismos secundários de degeneração causa desmielinização e morte de vários tipos de células 5-6. O grau de recuperação da função pode dedez ser correlacionado com a extensão da matéria branca poupado no local da lesão 7.
Os modelos animais de SCI pode ser usado tanto para investigar as respostas biológicas do tecido a lesão e para testar terapias potenciais. Além disso, um modelo animal útil de uma patologia humana, não só tem que reproduzem alguns aspectos dessa condição, mas deve também oferecer vantagens sobre observação clínica directa e experimento. Os modelos mais amplamente utilizados de lesão da medula espinal ou contusão envolvem compressão lesão entregue para a medula espinal exposta cirurgicamente 8. O desenvolvimento de uma contusão peso-drop controlados representam um marco importante na história da pesquisa SCI. O centro de pesquisa medula espinhal Ohio State University tem prosseguido o desafio tecnológico de um dispositivo que pode ser usado para induzir uma compressão particular da medula espinal com parâmetros de impacto controlado por um computador 9. Esta foi originalmente projetado para uso with ratos; mais tarde foi modificado para aplicar em direção camundongos 10. As vantagens deste tipo de abordagem é que a biomecânica da lesão pode ser estudado com mais profundidade e os parâmetros de lesão pode ser definida de uma maneira mais completa, a fim de obter um modelo experimental reproduzível, portanto, permitindo uma avaliação mais precisa dos efeitos de tratamentos testados sobre o processo de recuperação funcional.
Muitos estudos avaliaram os efeitos de transplante de uma variedade de células-tronco em modelos SCI 11. Temos recentemente isolado adultos neural células-tronco a partir da Sub-Ventricular Zone (SVZ) várias horas após a morte do doador do mouse 12-13. Este procedimento proporciona uma população de células-tronco neurais, chamado post mortem precursores neurais (PM-NPCs), que parecem ser vantajoso em uma abordagem da medicina regenerativa para curar SCI. Neste artigo vamos demonstrar: i) o protocolo de marcação celular com o PKH26 tracer vital, ii) o surgical procedimento para executar em SCI traumático, e iii) a administração intravenosa (iv) administração de células marcadas. Além disso, neste trabalho demonstram que as células transplantadas migrar para locais de lesão da medula espinhal e diferenciar principalmente em proteína associada microtúbulos (MAP) 2 células positivas. Além disso, a diferenciação é acompanhada pela promoção de uma recuperação estável da função dos membros posteriores.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste artigo é descrito um método para obter um modelo reprodutível de lesão medular traumática usando um Infinito Horizon Impactor com uma força de 70 Kdyne (grave). Usando um paradigma força maior (80 Kdyne), que pode causar uma lesão mais grave que, infelizmente, está associado à mortalidade camundongos mais elevados. Para evitar esse problema, é comumente escolher um paradigma força moderada (70 Kdyne) que está associado a uma lesão repetíveis com uma recuperação gradual da função e menor mortalid…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Authors acknowledge the economic support by FAIP (Federazione Associazioni Italiane Paraplegici), “Neurogel-en-Marche” Foundation (France), Fondazione “La Colonna”.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| PKH26GL-1KT | Sigma | 091M0973 | |
| Infinite horizon (IH) Impactor device | Precision Systems and Instrumentation, LLC | Model 0400 Serial 0171 | |
| Gentamycin 10mg/ml | Euroclone | ECM0011B | 1mg/ml in sterile saline solution |
| Isoflurane-Vet 250ml | Merial | B142J12A | |
| Blefarolin POM OFT 10g | |||
| Slide Warmer | 2Biological Instruments | HB101-sm-402 | |
| Scalpel, size 10 | Lance Paragon | 26920 | |
| Small Graefe Forceps | 2Biological Instruments | 11023-14 | |
| Rongeur | Medicon Instruments | 07 60 07 | |
| Micro scissors | 2Biological Instruments | 15000-00 | |
| Absorbable sutures (4/0) | Safil Quick | C0046203 | |
| Hemostat | 2Biological Instruments | 13014-14 | |
| Reflex 7 wound clip applicator | 2Biological Instruments | 12031-07 | |
| 7mm Reflex wound clips | 2Biological Instruments | 12032-07 | |
| NGS | Euroclone | ECS0200D | |
| Triton X 100 | Merck Millipore | 1086431000 | |
| Anti Microtubule Assocoated Protein (MAP) 2 | Millipore | AB5622 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | |
| FluorSave Reagent | Calbiochem | 345789 | |
| Neural stem cells medium | DMEM-F12 medium (Euroclone) containing 2 mm l-glutamine (Euroclone), 0.6% glucose (Sigma-Aldrich), 9.6 gm/ml putrescine (Sigma-Aldrich), 6.3 ng/ml progesterone (Sigma-Aldrich), 5.2 ng/ml sodium selenite (Sigma-Aldrich), 0.025 mg/ml insulin (Sigma-Aldrich), 0.1 mg/ml transferrin (Sigma-Aldrich), and 2 μg/ml heparin (sodium salt, grade II; Sigma-Aldrich), bFGF (human recombinant, 10 ng/mL; Life Technologies) and EGF (human recombinant, 20 ng/mL; Life Technologies) | ||
| DMEM-F12 | Euroclone | ASM5002 | |
| l-glutamine | Euroclone | ECB3000D | |
| glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| putrescine | Sigma-Aldrich | P5780-25G | |
| progesterone | Sigma-Aldrich | P6149-1MG | |
| Sodium-selenite | Sigma-Aldrich | S9133-1MG | |
| transferrin | Sigma-Aldrich | T 5391 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I1882 | |
| Heparin sodium-salt | Sigma-Aldrich | H0200000 | |
| bFGF | Life Technology | PHG0024 | |
| h-EGF | Life Technology | PHG6045 | |
| Syringe 0.33cc 29G | Terumo | MYJECTOR | |
| buprenorphine | Schering Plough SpA | TEMGESIC | |
| eye gel | Bausch & Lomb | LIPOSIC |
References
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