Neural Stem Cell Transplantation in Sperimentale Contusivi Model of Spinal Cord Injury
Summary
Lesioni del midollo spinale è una condizione traumatica che provoca grave morbilità e mortalità elevata. In questo lavoro descriviamo in dettaglio un modello contusione di lesioni del midollo spinale nei topi seguita da un trapianto di cellule staminali neurali.
Abstract
Lesioni del midollo spinale è una condizione clinica devastante, caratterizzato da un complesso di disfunzioni neurologiche. Modelli animali di lesione del midollo spinale possono essere utilizzati sia per indagare le risposte biologiche di lesioni e per testare potenziali terapie. Contusione o compressione lesioni consegnato al midollo spinale chirurgicamente esposti sono i più utilizzati modelli della patologia. In questa relazione la contusione sperimentale viene eseguita utilizzando il Infinite Horizon (IH) dispositivo di simulazione, che permette la creazione di un infortunio al modello animale riproducibile attraverso la definizione di parametri specifici sugli infortuni. Il trapianto di cellule staminali è comunemente considerata una strategia potenzialmente utile per la cura di questa condizione debilitante. Numerosi studi hanno valutato gli effetti di trapianto una varietà di cellule staminali. Qui mostriamo un metodo adeguato per le lesioni del midollo spinale seguita da iniezione vena della coda di cellule nei topi CD1. In breve, mettiamo a disposizione le procedure per: i) l'etichettatura delle cellule with un tracciante vitale, ii) la cura pre-operatoria di topi, iii) l'esecuzione di una lesione del midollo spinale contusivo, e iv) la somministrazione endovenosa di post mortem precursori neurali. Questo modello contusione può essere utilizzato per valutare l'efficacia e la sicurezza del trapianto di cellule staminali in un approccio di medicina rigenerativa.
Introduction
Una lesione al midollo spinale (SCI) è la lesione più comune causata da un trauma ad alta energia come autoveicoli incidenti, cadute, sport e violenza 1. In grave SCI, la forza lesioni distrugge o danneggia il tessuto neurale, causando la perdita improvvisa della funzione neurologica. Traumatic SCI si verifica spesso nei giovani adulti tra i 10 ei 40 anni di età. Essa colpisce notevolmente condizione mentale e fisica del paziente e provoca un enorme impatto economico per la società 2. L'approccio di trattamento in fase acuta è spesso limitata ad un alto dosaggio di corticosteroidi, la stabilizzazione chirurgica e decompressione per attenuare eventualmente ulteriori danni 3-4, ma i ruoli di questi metodi di recupero motorio dopo SCI sono ancora controversi. Oltre alla perdita di tessuto acuta, la lesione traumatica e l'attivazione di meccanismi secondari di degenerazione causa demielinizzazione e morte di diversi tipi di cellule 5-6. Il grado di recupero della funzione può diten essere correlato al tempo della sostanza bianca risparmiata al sito della lesione 7.
I modelli animali di SCI possono essere utilizzati sia per indagare le risposte biologiche del tessuto di pregiudizio e per testare potenziali terapie. Inoltre, un modello utile di una patologia umana animale non solo riprodurre alcuni aspetti di tale condizione, ma anche deve offrire vantaggi rispetto diretta osservazione clinica ed esperimento. I modelli più diffusi di lesioni del midollo spinale comportano contusione o compressione lesioni consegnato al midollo spinale chirurgicamente esposti 8. Lo sviluppo di un infortunio di peso-drop contusione controllato rappresentano una tappa importante nella storia della ricerca SCI. Il centro di ricerca midollo spinale Ohio State University ha perseguito la sfida tecnologica di un dispositivo che può essere utilizzato per indurre un particolare compressione del midollo spinale con parametri di impatto controllati da un computer 9. Questo è stato originariamente progettato per l'uso with ratti; successivamente è stato modificato per applicare verso topi 10. I vantaggi di questo tipo di approccio sono che la biomeccanica di lesioni possono essere studiati più in profondità e parametri di lesioni possono essere definiti in maniera più completa per ottenere un modello sperimentale riproducibile, permettendo quindi più precisa valutazione degli effetti trattamenti testati sul processo di recupero funzionale.
Molti studi hanno valutato gli effetti di trapianto di una varietà di cellule staminali in modelli SCI 11. Abbiamo recentemente isolato adulte neurali cellule staminali dal Sub-ventricolare Zone (SVZ) parecchie ore dopo la morte del donatore del mouse 12-13. Questa procedura prevede una popolazione di cellule staminali neurali, chiamato dopo mortem precursori neurali (PM-NPC), che sembrano essere vantaggiosa in un approccio di medicina rigenerativa per curare SCI. In questo articolo mostreremo: i) il protocollo per l'etichettatura delle cellule con il tracciante PKH26 vitale, ii) la surgProcedura iCal per eseguire a lesione traumatica, e iii) la via endovenosa (iv) la somministrazione di cellule marcate. Inoltre, in questo lavoro abbiamo dimostrato che le cellule trapiantate migrano verso siti di lesione del midollo spinale e si differenziano principalmente in microtubuli proteina associata (MAP) 2 cellule positive. Inoltre, la differenziazione è accompagnata dalla promozione di una ripresa stabile della funzione degli arti posteriori.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo articolo abbiamo descritto un metodo per ottenere un modello riproducibile di lesioni del midollo spinale traumatica con un Infinite Horizon urto con una forza di 70 Kdyne (grave). Utilizzando un paradigma forza maggiore (80 Kdyne), siamo in grado di causare un danno più grave che purtroppo è associato con la mortalità più elevati topi. Per evitare questo problema, che comunemente scelto un paradigma forza moderata (70 Kdyne) associato ad una lesione ripetibile con un progressivo recupero della funzione e …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Authors acknowledge the economic support by FAIP (Federazione Associazioni Italiane Paraplegici), “Neurogel-en-Marche” Foundation (France), Fondazione “La Colonna”.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| PKH26GL-1KT | Sigma | 091M0973 | |
| Infinite horizon (IH) Impactor device | Precision Systems and Instrumentation, LLC | Model 0400 Serial 0171 | |
| Gentamycin 10mg/ml | Euroclone | ECM0011B | 1mg/ml in sterile saline solution |
| Isoflurane-Vet 250ml | Merial | B142J12A | |
| Blefarolin POM OFT 10g | |||
| Slide Warmer | 2Biological Instruments | HB101-sm-402 | |
| Scalpel, size 10 | Lance Paragon | 26920 | |
| Small Graefe Forceps | 2Biological Instruments | 11023-14 | |
| Rongeur | Medicon Instruments | 07 60 07 | |
| Micro scissors | 2Biological Instruments | 15000-00 | |
| Absorbable sutures (4/0) | Safil Quick | C0046203 | |
| Hemostat | 2Biological Instruments | 13014-14 | |
| Reflex 7 wound clip applicator | 2Biological Instruments | 12031-07 | |
| 7mm Reflex wound clips | 2Biological Instruments | 12032-07 | |
| NGS | Euroclone | ECS0200D | |
| Triton X 100 | Merck Millipore | 1086431000 | |
| Anti Microtubule Assocoated Protein (MAP) 2 | Millipore | AB5622 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | |
| FluorSave Reagent | Calbiochem | 345789 | |
| Neural stem cells medium | DMEM-F12 medium (Euroclone) containing 2 mm l-glutamine (Euroclone), 0.6% glucose (Sigma-Aldrich), 9.6 gm/ml putrescine (Sigma-Aldrich), 6.3 ng/ml progesterone (Sigma-Aldrich), 5.2 ng/ml sodium selenite (Sigma-Aldrich), 0.025 mg/ml insulin (Sigma-Aldrich), 0.1 mg/ml transferrin (Sigma-Aldrich), and 2 μg/ml heparin (sodium salt, grade II; Sigma-Aldrich), bFGF (human recombinant, 10 ng/mL; Life Technologies) and EGF (human recombinant, 20 ng/mL; Life Technologies) | ||
| DMEM-F12 | Euroclone | ASM5002 | |
| l-glutamine | Euroclone | ECB3000D | |
| glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| putrescine | Sigma-Aldrich | P5780-25G | |
| progesterone | Sigma-Aldrich | P6149-1MG | |
| Sodium-selenite | Sigma-Aldrich | S9133-1MG | |
| transferrin | Sigma-Aldrich | T 5391 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I1882 | |
| Heparin sodium-salt | Sigma-Aldrich | H0200000 | |
| bFGF | Life Technology | PHG0024 | |
| h-EGF | Life Technology | PHG6045 | |
| Syringe 0.33cc 29G | Terumo | MYJECTOR | |
| buprenorphine | Schering Plough SpA | TEMGESIC | |
| eye gel | Bausch & Lomb | LIPOSIC |
References
- . Cord Injury Statistical Center: spinal cord injury facts and figures at glance Available from: https://www.nscisc.uab.edu/PublicDocuments/fact_figures_docs/Facts%202013.pdf (2013)
- Yip, P. K., Malaspina, A. Spinal cord trauma and the molecular point of no return. Molecular Neurodegeneration. 7, 6 (2012).
- Fehlings, M. G., Cadotte, D. W., Fehlings, L. N. A series of systematic reviews on the treatment of acute spinal cord injury: a foundation for best medical practice. J Neurotrauma. 28 (8), 1329-1333 (2011).
- Furlan, J. C., Noonan, V., Cadotte, D. W., Fehlings, M. G. Timing of decompressive surgery of spinal cord after traumatic spinal cord injury: an evidence-based examination of pre-clinical and clinical studies. J Neurotrauma. 28 (8), 1371-1399 (2011).
- Sekhon, L. H., Fehlings, M. G. Epidemiology, demographics, and pathophysiology of acute spinal cord injury. Spine. 26 (24), 2-12 (2001).
- Gorio, A., et al. Recombinant human erythropoietin counteracts secondary injury and markedly enhances neurological recovery from experimental spinal cord trauma. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (14), 9450-9455 (2002).
- Windle, W. F., Clemente, C. D., Chambers, W. W. Inhibition of formation of a glial barrier as a means of permitting a peripheral nerve to grow into the brain. J Comp Neurol. 96 (2), 359-369 (1952).
- Young, W. Spinal cord contusion models. Prog Brain Res. 137, 231-255 (2002).
- Stokes, B. T., Noyes, D. H., Behrmann, D. L. An electromechanical spinal injury device with dynamic sensitivity. J Neurotrauma. 9 (3), 187-195 (1992).
- Jakeman, L. B., et al. Traumatic spinal cord injury produced controlled contusion in mouse. J Neurotrauma. 17 (4), 299-319 (2000).
- Sahni, V., Kessler, J. A. Stem cell therapies for spinal cord injury. Nat Rev Neurol. 6, 363-372 (2010).
- Marfia, G., et al. Adult neural precursors isolated from post mortem brain yield mostly neurons: an erythropoietin-dependent process. Neurobiol Dis. 43 (1), 86-98 (2011).
- Gritti, A., et al. Multipotent neural stem cells reside into the rostral extension and olfactory bulb of adult rodents. J Neurosci. 22 (2), 437-445 (2002).
- Whetstone, W. D., Hsu, J. Y., Eisenberg, M., Werb, Z., Noble-Haeusslein, L. J. . J Neurosci Res. 74 (2), 227-239 (2003).
- Gonzalez-Lara, L. E., et al. The use of cellular magnetic resonance imaging to track the fate of iron-labeled multipotent stromal cells after direct transplantation in a mouse model of spinal cord injury. Mol Imaging Biol. 13 (4), 702-711 (2010).
- Ottobrini, L., et al. Magnetic resonance imaging of stem cell transplantation in injured mouse spinal cord. Cell R4. 2 (3), e963 (2014).
- Janowwski, M., et al. Neurotransplantation in mice: The concorde-like position ensures minimal cell leakage and widespread distribution of cells transplanted into the cistern magna. Neuroscience Letter. 430 (2), 169-174 (2008).
- Basso, D. M., et al. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. J Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
- Hofstetter, C. P., et al. Allodynia limits the usefulness of intraspinal neural stem cell grafts; directed differentiation improves outcome. Nat Neurosci. 8 (3), 346-353 (2005).
- Bottai, D., Madaschi, L., Di Giulio, A. M., Gorio, A. Viability-dependent promoting action of adult neural precursors in spinal cord injury. Mol. Med. 14 (9-10), 634-644 (2008).
- Bottai, D., et al. Embryonic stem cells promote motor recovery and affect inflammatorycell infiltration in spinal cord injured mice. Exp Neurol. 223 (2), 452-463 (2010).
