Neural Transplantation de cellules souches dans la partie expérimentale Modèle contusion de la moelle épinière des blessures
Summary
Lésion de la moelle épinière est une condition traumatique qui entraîne une morbidité grave et une mortalité élevée. Dans ce travail, nous décrivons en détail un modèle de contusion de blessure de la moelle épinière chez la souris suivie d'une transplantation de cellules souches neurales.
Abstract
Lésion de la moelle épinière est un état clinique dévastateur, caractérisé par un complexe de dysfonctionnements neurologiques. Les modèles animaux de lésions de la moelle épinière peuvent être utilisés à la fois pour enquêter sur les réponses biologiques à des blessures et de tester des thérapies potentielles. Contusion ou compression délivrée blessure à la moelle épinière exposée chirurgicalement sont les modèles les plus répandus de la pathologie. Dans ce rapport, la contusion expérimentale est effectuée en utilisant l'horizon infini (IH) dispositif de Impactor, qui permet la création d'un modèle animal de lésion reproductible par la définition des paramètres de blessures spécifiques. la transplantation de cellules souches est généralement considérée comme une stratégie potentiellement utile pour guérir cette maladie débilitante. De nombreuses études ont évalué les effets de la transplantation de diverses cellules souches. Ici, nous démontrons une méthode adaptée pour les blessures de la moelle épinière suivie par injection dans la veine de la queue de cellules dans des souris CD1. En bref, nous fournissons les procédures pour: i) le marquage cellulaire wie un traceur vitale, ii) soins pré-opératoires de souris, iii) l'exécution d'une blessure de la moelle épinière contondante, et iv) l'administration intraveineuse de post mortem précurseurs neuraux. Ce modèle de contusion peut être utilisé pour évaluer l'efficacité et l'innocuité de la transplantation de cellules souches dans une approche de la médecine régénératrice.
Introduction
Une blessure de la moelle épinière (SCI) est la blessure la plus courante causée par un traumatisme à haute énergie comme les véhicules automobiles accidents, les chutes, les sports et la violence 1. En graves SCI, la force des blessures détruit ou endommage les tissus nerveux, causant une perte soudaine de la fonction neurologique. Traumatique SCI se produit fréquemment chez les jeunes adultes entre 10 et 40 ans. Il affecte grandement état mental et physique du patient et provoque un énorme impact économique pour la société 2. L'approche de traitement à la phase aiguë est souvent limitée à une forte dose de corticostéroïdes, la stabilisation et la décompression chirurgicale pour atténuer éventuellement d'autres dommages 3-4, mais les rôles de ces méthodes sur la récupération locomotrice après SCI sont encore controversée. En plus de la perte de tissu aigu, la lésion traumatique et l'activation des mécanismes secondaires causes de la dégénérescence et de la mort démyélinisation de plusieurs types de cellules 6.5. Le degré de récupération de la fonction peut dedix être corrélée à la mesure de la substance blanche ménagé au site de la lésion 7.
Les modèles animaux de SCI peuvent être utilisés à la fois pour étudier les réponses biologiques des tissus à des blessures et de tester des thérapies potentielles. En outre, un modèle animal utile d'une pathologie humaine a non seulement de reproduire certains aspects de cette condition, mais aussi doit offrir des avantages plus de l'observation clinique directe et expérience. Les modèles les plus largement utilisés de blessures de la moelle épinière impliquent une contusion ou une compression des blessures livré à la moelle épinière exposé chirurgicalement 8. Le développement d'une blessure contusion poids baisse contrôlée représente un jalon important dans l'histoire de la recherche SCI. Le centre de recherche sur la moelle épinière Ohio State University a poursuivi le défi technologique d'un dispositif qui peut être utilisé pour induire une compression particulière de la moelle épinière avec des paramètres d'impact contrôlées par un ordinateur neuf. Cela a été initialement conçu pour une utilisation wie rats; plus tard, il a été modifié pour se appliquer à 10 souris. Les avantages de ce type d'approche sont que les biomécanique de blessures peuvent être étudiés plus en profondeur et les paramètres de blessures peuvent être définis d'une manière plus complète afin d'obtenir un modèle expérimental reproductible, permettant ainsi une évaluation plus précise des effets de traitements testés sur le processus de récupération fonctionnelle.
De nombreuses études ont évalué les effets de la transplantation d'une variété de cellules souches dans des modèles 11 SCI. Nous avons récemment isolé adultes de neurones cellules souches de la zone sous-ventriculaire (SVZ) plusieurs heures après la mort du donneur de la souris 12-13. Cette procédure prévoit une population de cellules souches neurales, appelé après mortem précurseurs neuraux (PM-PNJ), qui semblent être avantageux dans une approche de la médecine régénérative pour guérir SCI. Dans cet article nous allons le démontrer: i) le protocole de marquage des cellules avec le traceur PKH26 vitale, ii) l'Surgical procédure à effectuer sur lésions médullaires traumatiques, et iii) la voie intraveineuse (iv) l'administration de cellules marquées. En outre, dans ce travail, nous démontrons que les cellules transplantées migrent vers les sites de lésion de la moelle épinière et se différencient principalement en protéines associée aux microtubules (MAP) 2 cellules positives. De plus, la différenciation se accompagne de la promotion d'une récupération stable de la fonction des membres postérieurs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cet article, nous avons décrit une méthode pour obtenir un modèle reproductible de blessures de la moelle épinière en utilisant un impacteur Horizon Infini à une force de 70 Kdyne (sévère). En utilisant une force plus importante paradigme (80 Kdyne), nous pouvons causer une blessure plus grave que, malheureusement, est associée à une mortalité des souris élevées. Afin d'éviter ce problème, nous choisissons généralement un paradigme de force modérée (70 Kdyne) qui est associée à une lésion …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Authors acknowledge the economic support by FAIP (Federazione Associazioni Italiane Paraplegici), “Neurogel-en-Marche” Foundation (France), Fondazione “La Colonna”.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| PKH26GL-1KT | Sigma | 091M0973 | |
| Infinite horizon (IH) Impactor device | Precision Systems and Instrumentation, LLC | Model 0400 Serial 0171 | |
| Gentamycin 10mg/ml | Euroclone | ECM0011B | 1mg/ml in sterile saline solution |
| Isoflurane-Vet 250ml | Merial | B142J12A | |
| Blefarolin POM OFT 10g | |||
| Slide Warmer | 2Biological Instruments | HB101-sm-402 | |
| Scalpel, size 10 | Lance Paragon | 26920 | |
| Small Graefe Forceps | 2Biological Instruments | 11023-14 | |
| Rongeur | Medicon Instruments | 07 60 07 | |
| Micro scissors | 2Biological Instruments | 15000-00 | |
| Absorbable sutures (4/0) | Safil Quick | C0046203 | |
| Hemostat | 2Biological Instruments | 13014-14 | |
| Reflex 7 wound clip applicator | 2Biological Instruments | 12031-07 | |
| 7mm Reflex wound clips | 2Biological Instruments | 12032-07 | |
| NGS | Euroclone | ECS0200D | |
| Triton X 100 | Merck Millipore | 1086431000 | |
| Anti Microtubule Assocoated Protein (MAP) 2 | Millipore | AB5622 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | |
| FluorSave Reagent | Calbiochem | 345789 | |
| Neural stem cells medium | DMEM-F12 medium (Euroclone) containing 2 mm l-glutamine (Euroclone), 0.6% glucose (Sigma-Aldrich), 9.6 gm/ml putrescine (Sigma-Aldrich), 6.3 ng/ml progesterone (Sigma-Aldrich), 5.2 ng/ml sodium selenite (Sigma-Aldrich), 0.025 mg/ml insulin (Sigma-Aldrich), 0.1 mg/ml transferrin (Sigma-Aldrich), and 2 μg/ml heparin (sodium salt, grade II; Sigma-Aldrich), bFGF (human recombinant, 10 ng/mL; Life Technologies) and EGF (human recombinant, 20 ng/mL; Life Technologies) | ||
| DMEM-F12 | Euroclone | ASM5002 | |
| l-glutamine | Euroclone | ECB3000D | |
| glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| putrescine | Sigma-Aldrich | P5780-25G | |
| progesterone | Sigma-Aldrich | P6149-1MG | |
| Sodium-selenite | Sigma-Aldrich | S9133-1MG | |
| transferrin | Sigma-Aldrich | T 5391 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I1882 | |
| Heparin sodium-salt | Sigma-Aldrich | H0200000 | |
| bFGF | Life Technology | PHG0024 | |
| h-EGF | Life Technology | PHG6045 | |
| Syringe 0.33cc 29G | Terumo | MYJECTOR | |
| buprenorphine | Schering Plough SpA | TEMGESIC | |
| eye gel | Bausch & Lomb | LIPOSIC |
References
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