Neural stamcellstransplantation i experimentell Contusive Modell av ryggmärgsskada
Summary
Ryggmärgsskada är en traumatisk tillstånd som orsakar svår sjuklighet och hög dödlighet. I detta arbete har vi i detalj beskriva en kontusion modell av ryggmärgsskada hos möss följt av en transplantation av neurala stamceller.
Abstract
Ryggmärgsskada är en förödande kliniska tillstånd, som kännetecknas av ett komplex av neurologiska dysfunktioner. Djurmodeller av ryggmärgsskada kan användas både för att undersöka de biologiska svar på skada och för att testa potentiella behandlingar. Kontusion eller kompressionsskada levereras till den kirurgiskt exponerade ryggmärgen är de mest använda modellerna av patologin. I denna rapport den experimentella kontusion utförs med hjälp av oändliga Horizon (IH) Impactor enhet, vilket möjliggör skapandet av en reproducerbar skada djurmodell genom definition av specifika skadeparametrar. Stamcellstransplantation är allmänt betraktas som en potentiellt användbar strategi för att bota detta försvagande tillstånd. Talrika studier har utvärderat effekterna av transplantera en mängd av stamceller. Här kan vi visa en anpassad metod för ryggmärgsskada följt av injektion i svansvenen av celler i CD 1-möss. Kort sagt, vi ger rutiner för: i) cellmärkning with en viktig spårämne, ii) preoperativ vård av möss, iii) genomförande av en Contusive ryggmärgsskada, och iv) intravenös administrering av obduktions neurala prekursorer. Denna kontusion modellen kan användas för att utvärdera effekt och säkerhet av stamcellstransplantation i en regenerativ medicin tillvägagångssätt.
Introduction
En ryggmärgsskada (SCI) är den vanligaste skadan som orsakas av hög energi trauma som motorfordon olyckor, faller, sport och våld 1. Vid svår SCI, förstör skadan kraften eller skadestånd nervvävnad, vilket orsakar plötslig förlust av neurologisk funktion. Traumatisk SCI förekommer ofta i unga vuxna mellan 10 och 40 års ålder. Det påverkar i hög grad patientens psykiska och fysiska tillstånd och orsakar enorma ekonomiska konsekvenserna för samhället 2. Den behandlingsform i det akuta skedet är ofta begränsad till en hög dos av kortikosteroid, kirurgisk stabilisering och dekompression att eventuellt dämpa ytterligare skador 3-4, men de roller dessa metoder på rörelse återhämtning efter SCI är fortfarande kontroversiell. Förutom akut vävnadsförlust, den traumatiska skador och aktivering av sekundära mekanismer av degeneration orsakar demyelinisering och död av flera celltyper 5-6. Graden av återhämtning av funktionen kan avtio korreleras till omfattningen av skonas vita substansen vid skada plats 7.
Djurmodeller av SCI kan användas både för att undersöka de biologiska svaren från vävnaden till skada och att testa potentiella behandlingar. Dessutom har en användbar djurmodell av en mänsklig patologi inte bara att återge vissa aspekter av detta villkor, utan även måste erbjuda fördelar jämfört direkt klinisk observation och experiment. De mest använda modeller av ryggmärgsskada involverar kontusion eller kompressionsskada levereras till kirurgiskt exponerade ryggmärgen 8. Utvecklingen av en kontrollerad vikt-släpp kontusion skada utgör en viktig milstolpe i historien om SCI forskningen. Ohio State University ryggmärg forskningscentrum har bedrivit den tekniska utmaningen av en anordning som kan användas för att framkalla en viss kompression av ryggmärgen med parametrar för påverkan styrs av en dator 9. Detta var ursprungligen avsedd för användning with råttor; senare modifierades att gälla mot möss 10. Fördelarna med denna typ av metod är att biomekanik skada kan studeras mer ingående och parametrarna för skada kan definieras på ett mer fullständigt sätt i syfte att erhålla ett reproducerbart experimentell modell, därför tillåta mer exakt bedömning av effekterna av testade behandlingar på den funktionella återhämtningen.
Många studier har utvärderat transplantations effekterna av en mängd olika stamceller i SCI-modeller 11. Vi har nyligen isolerade vuxna neurala stamceller från Sub-ventrikulära zonen (SVZ) flera timmar efter döden av musen donator 12-13. Detta förfarande ger en population av neurala stamceller, kallad post mortem neurala prekursorer (PM-NPC), som tycks vara fördelaktigt i en regenerativ medicin metod för att bota SCI. I denna uppsats kommer vi att demonstrera: i) protokoll för cellmärkning med den vitala spårämnet PKH26, ii) surgical förfarande för att utföra på traumatisk SCI, och iii) intravenös (iv) administrering av märkta celler. Dessutom i detta arbete visar vi att transplanterade celler migrerar till ryggmärgsskada platser och differentiera mestadels i mikrotubuli associerat protein (MAP) 2 positiva celler. Vidare är differentieringen åtföljs av främjande av en stabil återhämtning av bakbensfunktionen.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna uppsats beskrev vi en metod för att erhålla en reproducerbar modell av traumatisk ryggmärgsskada med hjälp av en oändlig Horizon Impactor vid en kraft på 70 Kdyne (svår). Med hjälp av en större kraft paradigm (80 Kdyne), kan vi orsaka en allvarligare skada som tyvärr är förknippad med högre möss dödlighet. För att undvika detta problem, väljer vi ofta en måttlig kraft paradigm (70 Kdyne) som är associerad till en repeterbar lesion med en gradvis återhämtning av funktion och lägre dödlighet…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Authors acknowledge the economic support by FAIP (Federazione Associazioni Italiane Paraplegici), “Neurogel-en-Marche” Foundation (France), Fondazione “La Colonna”.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| PKH26GL-1KT | Sigma | 091M0973 | |
| Infinite horizon (IH) Impactor device | Precision Systems and Instrumentation, LLC | Model 0400 Serial 0171 | |
| Gentamycin 10mg/ml | Euroclone | ECM0011B | 1mg/ml in sterile saline solution |
| Isoflurane-Vet 250ml | Merial | B142J12A | |
| Blefarolin POM OFT 10g | |||
| Slide Warmer | 2Biological Instruments | HB101-sm-402 | |
| Scalpel, size 10 | Lance Paragon | 26920 | |
| Small Graefe Forceps | 2Biological Instruments | 11023-14 | |
| Rongeur | Medicon Instruments | 07 60 07 | |
| Micro scissors | 2Biological Instruments | 15000-00 | |
| Absorbable sutures (4/0) | Safil Quick | C0046203 | |
| Hemostat | 2Biological Instruments | 13014-14 | |
| Reflex 7 wound clip applicator | 2Biological Instruments | 12031-07 | |
| 7mm Reflex wound clips | 2Biological Instruments | 12032-07 | |
| NGS | Euroclone | ECS0200D | |
| Triton X 100 | Merck Millipore | 1086431000 | |
| Anti Microtubule Assocoated Protein (MAP) 2 | Millipore | AB5622 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | |
| FluorSave Reagent | Calbiochem | 345789 | |
| Neural stem cells medium | DMEM-F12 medium (Euroclone) containing 2 mm l-glutamine (Euroclone), 0.6% glucose (Sigma-Aldrich), 9.6 gm/ml putrescine (Sigma-Aldrich), 6.3 ng/ml progesterone (Sigma-Aldrich), 5.2 ng/ml sodium selenite (Sigma-Aldrich), 0.025 mg/ml insulin (Sigma-Aldrich), 0.1 mg/ml transferrin (Sigma-Aldrich), and 2 μg/ml heparin (sodium salt, grade II; Sigma-Aldrich), bFGF (human recombinant, 10 ng/mL; Life Technologies) and EGF (human recombinant, 20 ng/mL; Life Technologies) | ||
| DMEM-F12 | Euroclone | ASM5002 | |
| l-glutamine | Euroclone | ECB3000D | |
| glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| putrescine | Sigma-Aldrich | P5780-25G | |
| progesterone | Sigma-Aldrich | P6149-1MG | |
| Sodium-selenite | Sigma-Aldrich | S9133-1MG | |
| transferrin | Sigma-Aldrich | T 5391 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I1882 | |
| Heparin sodium-salt | Sigma-Aldrich | H0200000 | |
| bFGF | Life Technology | PHG0024 | |
| h-EGF | Life Technology | PHG6045 | |
| Syringe 0.33cc 29G | Terumo | MYJECTOR | |
| buprenorphine | Schering Plough SpA | TEMGESIC | |
| eye gel | Bausch & Lomb | LIPOSIC |
References
- . Cord Injury Statistical Center: spinal cord injury facts and figures at glance Available from: https://www.nscisc.uab.edu/PublicDocuments/fact_figures_docs/Facts%202013.pdf (2013)
- Yip, P. K., Malaspina, A. Spinal cord trauma and the molecular point of no return. Molecular Neurodegeneration. 7, 6 (2012).
- Fehlings, M. G., Cadotte, D. W., Fehlings, L. N. A series of systematic reviews on the treatment of acute spinal cord injury: a foundation for best medical practice. J Neurotrauma. 28 (8), 1329-1333 (2011).
- Furlan, J. C., Noonan, V., Cadotte, D. W., Fehlings, M. G. Timing of decompressive surgery of spinal cord after traumatic spinal cord injury: an evidence-based examination of pre-clinical and clinical studies. J Neurotrauma. 28 (8), 1371-1399 (2011).
- Sekhon, L. H., Fehlings, M. G. Epidemiology, demographics, and pathophysiology of acute spinal cord injury. Spine. 26 (24), 2-12 (2001).
- Gorio, A., et al. Recombinant human erythropoietin counteracts secondary injury and markedly enhances neurological recovery from experimental spinal cord trauma. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (14), 9450-9455 (2002).
- Windle, W. F., Clemente, C. D., Chambers, W. W. Inhibition of formation of a glial barrier as a means of permitting a peripheral nerve to grow into the brain. J Comp Neurol. 96 (2), 359-369 (1952).
- Young, W. Spinal cord contusion models. Prog Brain Res. 137, 231-255 (2002).
- Stokes, B. T., Noyes, D. H., Behrmann, D. L. An electromechanical spinal injury device with dynamic sensitivity. J Neurotrauma. 9 (3), 187-195 (1992).
- Jakeman, L. B., et al. Traumatic spinal cord injury produced controlled contusion in mouse. J Neurotrauma. 17 (4), 299-319 (2000).
- Sahni, V., Kessler, J. A. Stem cell therapies for spinal cord injury. Nat Rev Neurol. 6, 363-372 (2010).
- Marfia, G., et al. Adult neural precursors isolated from post mortem brain yield mostly neurons: an erythropoietin-dependent process. Neurobiol Dis. 43 (1), 86-98 (2011).
- Gritti, A., et al. Multipotent neural stem cells reside into the rostral extension and olfactory bulb of adult rodents. J Neurosci. 22 (2), 437-445 (2002).
- Whetstone, W. D., Hsu, J. Y., Eisenberg, M., Werb, Z., Noble-Haeusslein, L. J. . J Neurosci Res. 74 (2), 227-239 (2003).
- Gonzalez-Lara, L. E., et al. The use of cellular magnetic resonance imaging to track the fate of iron-labeled multipotent stromal cells after direct transplantation in a mouse model of spinal cord injury. Mol Imaging Biol. 13 (4), 702-711 (2010).
- Ottobrini, L., et al. Magnetic resonance imaging of stem cell transplantation in injured mouse spinal cord. Cell R4. 2 (3), e963 (2014).
- Janowwski, M., et al. Neurotransplantation in mice: The concorde-like position ensures minimal cell leakage and widespread distribution of cells transplanted into the cistern magna. Neuroscience Letter. 430 (2), 169-174 (2008).
- Basso, D. M., et al. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. J Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
- Hofstetter, C. P., et al. Allodynia limits the usefulness of intraspinal neural stem cell grafts; directed differentiation improves outcome. Nat Neurosci. 8 (3), 346-353 (2005).
- Bottai, D., Madaschi, L., Di Giulio, A. M., Gorio, A. Viability-dependent promoting action of adult neural precursors in spinal cord injury. Mol. Med. 14 (9-10), 634-644 (2008).
- Bottai, D., et al. Embryonic stem cells promote motor recovery and affect inflammatorycell infiltration in spinal cord injured mice. Exp Neurol. 223 (2), 452-463 (2010).
