Een mogelijke zebravis model van PKD: Knockdown van<em> Wnt5a</em> Oorzaken Cysten in zebravis Nieren
Summary
We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.
Abstract
Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG – and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to “off-target” effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.
Introduction
Zebravis (Danio rerio) embryo's zijn op grote schaal gebruikt als een model voor het bestuderen van de ontwikkeling van de nieren en polycysteuze nierziekte. Er zijn vele voordelen aan het gebruik zebravis als diermodel: de haalbaarheid van het bestuderen van genetische interacties, het vermogen om antisense morfolino (MO) gebruikt voor proteïne knockdown, de mogelijkheid om snel assay grote aantallen embryo's, en het kijkgemak orgaan fenotypes levende larven 1. De pronephros is de eerste nier te ontwikkelen in vertebraten en functioneel is in larvale zebravis 2. De structuur van de zebravis pronephros relatief eenvoudig in vergelijking met de zoogdier metanefros, de derde en laatste nier ontwikkelen bij zoogdieren. De nefron is de werkeenheid van de nier, waarbij elke humane nier die tussen 500,000-1,000,000 nefronen 3,4 en elke muis nier met ongeveer 13.000 nefronen 5, waardoor het moeilijk om één nefron structuur waarnemen in mens of muis nieren. De zebravis heeft slechts twee nefronen, en elke zebravis nefron bevat alle belangrijke componenten in de glomerulus en buisjes van muizen en mensen 6 en soortgelijke gespecialiseerde renale celtypen. Vergeleken met andere gewervelde modellen zoals Xenopus, zebravis het nefron meer lijkt het zoogdier nefron omdat het een gesloten systeem 7.
De laatste jaren heeft de zebravis genoom sequentie is bepaald, waardoor de brede invoering van genetische hulpmiddelen, uitgebreide mutant middelen en verzamelingen van transgene reporter lijnen zebravismodellen. De zebravis pronephros vormt tussen 12-72 uur na bevruchting (HPF) en kan gemakkelijk worden gevisualiseerd in de transparante embryo. De Wilm's tumor WT1 eiwit is een essentiële factor voor de ontwikkeling van de nieren. Transgene zebravis lijnen expressie groen fluorescent proteïne (GFP) onder de controle van de promoter wt1b Tg (wt1b: GFP) tonen GFP Expression specifiek gelegen in pronephric regio's in de zebravis embryo's, vanaf 17 HPF 8. Nephronophthisis (NPHP), een autosomaal recessieve cystische nierziekte, veroorzaakt door mutaties van genen NPHP 9. NPHP4 knockdown door morfolinogroep veroorzaakt vorming van cysten in de Tg (wt1b: GFP). Vis 10 Daarom is deze transgene vis is een geschikt model voor het observeren van de nieren structuren en cyste vorming tijdens de ontwikkeling nier. Belangrijk is, kan de invloed van modulatoren van nierontwikkeling bestudeerd door deze stam in tijd en arbeid efficiënte wijze.
Onze paper beschrijft het gebruik van Tg (wt1b: GFP) vis als een model om de nieren cyste vorming visualiseren na genmodulatie. We gebruikten start- en splice-terrein anti-sense MO's af te breken de Wnt5a gen in de zebravis. Wnt5a is een niet-canonieke uitgescheiden glycoproteïne van de familie Wnt die een belangrijke rol speelt in de ontwikkeling van verschillende organen en postnatale cellulairefunctie 11. Wnt5a werkt door Wnt banen, waaronder de vlakke cel polariteit (PCP) route, die is gevonden om een rol georiënteerde celdeling spelen tijdens renale tubulaire rek. Wnt5a regelt de Wnt / PCP reactieweg door een complex te vormen met de receptor, zoals tyrosine kinase (Ryk), die verder overbrengt Wnt5a signalering door vorming van een complex met de VANGL vlakke cel polariteit eiwit 2 (Vangl2), waardoor Vangl2 stabiliteit 12 bevorderen. Defecten in het PCP traject kan resulteren in willekeurige celdeling en veroorzaken niercyste formatie. We gebruikten de Tg (wt1b: GFP) zebravis lijn naar de nieren cyste vorming observeren volgende Wnt5a knockdown. De Tg (wt1b: GFP) zebravis model maakt live beeldvorming en tijdige waarneming van nier structuur. Na Wnt5a knock-down, werd niercyste formatie gevonden beginnend bij 24 hpf; 72 HPF cysten kan worden gevonden in de glomeruli en de proximale tubuli. Deze werkwijze kan ook worden gebruikt om screen andere genen die de nieren cyste vorming kunnen veroorzaken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Polycystische nierziekte (PKD) is een van de belangrijkste oorzaken van eindstadium nierziekte bij de mens en wordt gekenmerkt door progressieve cyste vorming, nier- uitbreiding, en abnormale tubulus ontwikkeling 14. Autosomaal dominant PKD (ADPKD) is een genetische ziekte waarbij mutatie van hetzij PKD1, codeert polycystine-1 (PC1) of PKD2, codeert polycystine-2 (PC2), resultaten in polycysteuze nieren. Vele andere genen, vooral die coderen voor eiwitten in de primaire cilium, wordt gedacht betrokken te zijn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de NIH (DK093625 aan LH en DK069909 en DK047757 naar JHL) en de VA (Merit Award I01BX000820 aan JHL). We willen graag Dr Michael Pack en Dr. Jie Hij dankt aan de Universiteit van Pennsylvania zebravis Core voor het verstrekken van essentiële ondersteuning.
Materials
| 0.5% Phenol-Red | Sigma | P0290 | Color indicator for injection |
| Morpholino | Genn Tools, LLC | (customized) | Customized designed to the gene of interest |
| Pre-pulled needle | Tritech Research | MINJ-PP | If large amount of needle is required, you can also purchase a needle puller and prepare the needle in the lab |
| T7 mMessage Kit | Ambion | 1344 | For in vitro transcription to make capped mRNA for rescue experiment |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629 | For prevention of melanization |
| Tricaine | Sigma | A5040 | Also called ethyl 3-aminobenzoate, for zebrafish anesthesia |
| Methyl Cellulose | Sigma | M-0387 | For position of zebrafish |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | For purification of PCR product for cap RNA synthesis. |
| dNTP mix | Promega | U1511 | For PCR |
| Tag DNA Polymerase | Invitrogen | 10342-053 | For PCR |
| Equipment | |||
| NanoDrop sepctrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | For measure morpholino and RNA concentration |
| Air Compressor | Werther International, Inc. | Panther Compact 106 | Air source for injection |
| Pico micro-injection pump | World Precision Instruments Inc | PV830 Pnematic PicoPump | Other types of microinjection system can be used. |
| Micro-manuplator | World Precision Instruments Inc | MMJR | Right-handed (MMJL for left handed) |
| Needle holder | World Precision Instruments Inc | 5430-ALL | To hold needle for micromanipulation |
| Dumont Tweezers | Fine Surgical Tools | 11253-20 | For breaking off the needle tip |
| Dissecting microscope | Leica M205C | For observing and imaging zebrafish embryos | |
| Fluorscence microscope | Zeiss Axio Obserer D1m | For imaging zebrafish pronephros | |
| Capillary tube (I.D 0.15 mm) | VitroCom | CV1525Q-100 | For measure the volume of each injected drop |
References
- Choi, S. Y., et al. Cdc42 deficiency causes ciliary abnormalities and cystic kidneys. J Am Soc Nephrol. 24 (9), 1435-1450 (2013).
- Hostetter, C. L., Sullivan-Brown, J. L., Burdine, R. D. Zebrafish pronephros: a model for understanding cystic kidney disease. Dev Dyn. 228 (3), 514-522 (2003).
- Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. Anat Rec. 232 (2), 514-201 (1992).
- Keller, G., Zimmer, G., Mall, G., Ritz, E., Amann, K. Nephron number in patients with primary hypertension. N Engl J Med. 348 (2), 101-108 (2003).
- Cullen-McEwen, L. A., Kett, M. M., Dowling, J., Anderson, W. P., Bertram, J. F. Nephron number, renal function, and arterial pressure in aged GDNF heterozygous mice. Hypertension. 41 (2), 335-340 (2003).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).
- Igarashi, P. Overview: nonmammalian organisms for studies of kidney development and disease. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 296-298 (2005).
- Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am J Physiol Renal Physiol. 299 (5), 1040-1047 (2010).
- Liu, S., et al. A defect in a novel Nek-family kinase causes cystic kidney disease in the mouse and in zebrafish. Development. 129 (24), 5839-5846 (2002).
- Slanchev, K., Putz, M., Schmitt, A., Kramer-Zucker, A., Walz, G. Nephrocystin-4 is required for pronephric duct-dependent cloaca formation in zebrafish. Hum Mol Genet. 20 (16), 3119-3128 (2011).
- Huang, L., et al. The role of Wnt5a in prostate gland development. Dev Biol. 328 (2), 188-199 (2009).
- Andre, P., et al. The Wnt coreceptor Ryk regulates Wnt/planar cell polarity by modulating the degradation of the core planar cell polarity component Vangl2. J Biol Chem. 287 (53), 44518-44525 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. Autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).
