Un modèle de poisson zèbre possible de la maladie polykystique des reins: Knockdown de<em> Wnt5a</em> Causes kystes chez le poisson zèbre reins

Summary

We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.

Abstract

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG – and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to “off-target” effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.

Introduction

Poisson zèbre (Danio rerio) embryons ont été largement utilisé comme un modèle pour étudier le développement du rein et la polykystose rénale. Il existe de nombreux avantages à l'utilisation du poisson zèbre comme modèle animal: la faisabilité de l'étude des interactions génétiques, la capacité d'utiliser morpholinos antisens (MO) pour la protéine knockdown, la possibilité de doser rapidement un grand nombre d'embryons, et la facilité de visualisation des phénotypes d'organes en ^une larves vivantes. Les pronéphros est le premier rein à développer chez les vertébrés et est fonctionnel chez le poisson zèbre larves ^2. La structure des pronéphros poisson zèbre est relativement simple par rapport à métanéphros mammifères, la troisième et dernière rein de développer chez les mammifères. Le néphron est l'unité de travail du rein, rein humain avec chacun contenant entre ^3,4 et 500,000-1,000,000 néphrons chaque rein de souris ayant environ 13000 néphrons ^5, il est difficile d'observer la structure de néphron unique in reins humains ou de souris. Le poisson zèbre n'a que deux néphrons, et chaque néphron poisson zèbre contient tous les composants majeurs trouvés dans le glomérule et les tubules de souris et les humains ⁶ et types similaires de cellules rénales spécialisés. Par rapport à d'autres modèles de vertébrés tels que Xenopus, le poisson zèbre néphron ressemble plus étroitement néphron de mammifère parce qu'il a un système fermé ^7.

Au cours des dernières années, le génome du poisson zèbre a été séquencé, ce qui permet la mise en place de l'ensemble des outils génétiques, de vastes ressources mutantes et des collections de lignées rapporteuses dans des modèles transgéniques de poisson zèbre. Les pronéphros de poisson zèbre formes entre 12-72 heures après la fécondation (HPF) et peuvent être visualisées facilement dans les embryons transparents. La protéine de tumeur du Wilm WT1 est un facteur essentiel pour le développement du rein. Lignes de poisson zèbre transgéniques exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) sous le contrôle du promoteur de wt1b Tg (wt1b: GFP) montrer GFP EXPREssion spécifiquement situé dans les régions pronephrique dans embryons de poisson zèbre, à partir de 17 hpf ^8. Néphronophtise (NPHP), une maladie du rein kystique autosomique récessive, est causée par des mutations de gènes NPHP ^neuf. NPHP4 knockdown morpholino causé par la formation de kystes dans la Tg (wt1b: GFP). Poisson ¹⁰ Par conséquent, ce poisson transgénique est un modèle approprié pour l'observation des structures de rein et la formation de kystes au cours du développement rénal. Fait important, l'influence des modulateurs de développement du rein peut être étudiée en utilisant cette souche dans un temps et du travail de manière efficace.

Notre article décrit l'utilisation de Tg (wt1b: GFP) poisson comme un modèle de visualiser la formation de kystes rénaux après modulation génique. Nous avons utilisé le site d'épissage de début et anti-sens OM pour abattre le gène Wnt5a chez le poisson zèbre. Wnt5a est une glycoprotéine sécrétée non-canonique de la famille Wnt qui joue un rôle important dans le développement de divers organes et postnatal cellulairefonction ^11. Wnt5a fonctionne par des voies Wnt non canoniques, y compris la voie de la polarité cellulaire planaire (PCP), qui se est révélé jouer un rôle dans la division cellulaire lors de l'allongement orienté tubulaire rénale. Wnt5a régule la voie / PCP Wnt en formant un complexe avec le récepteur, comme la tyrosine kinase (Ryk), qui transduit en outre signalisation Wnt5a en formant un complexe avec le VANGL protéine de la polarité cellulaire plane 2 (Vangl2), favorisant ainsi Vangl2 stabilité ^12. Défauts dans la voie de PCP peuvent entraîner dans la division cellulaire aléatoire et provoquer la formation de kyste rénal. Nous avons utilisé le Tg (wt1b: GFP) ligne poisson zèbre pour observer la formation de kystes rénaux suivante Wnt5a knockdown. Le Tg (wt1b: GFP) modèle de poisson zèbre permet l'imagerie en direct et l'observation en temps opportun de la structure du rein. Après Wnt5a knockdown, la formation de kystes rénaux a été trouvée à partir de 24 hpf; à 72 HPF, les kystes peuvent être trouvés dans les glomérules et les tubules proximaux. Cette méthode peut également être utilisée pour sCreen autres gènes qui pourraient provoquer la formation de kystes rénaux.

Protocol

Déclaration de l'éthique: NOTE: Toutes les expériences de poisson zèbre ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle à l'Eastern Virginia Medical School. 1. Préparation Morpholino Conception et traduction synthétiser-blocage (août-) et épissage inhiber (jonction ou) anti-sens morpholino (MO) oligonucléotides pour le gène d'intérêt selon les instructions du fabricant (figure 1A). Se il vous plaît voir les inform…

Representative Results

Wnt5a abattre a été réalisé par l'introduction traduction bloquant MO (AUG-MO) ou de l'exon / intron jonction des frontières MO (épissage MO) pour embryons de poisson zèbre au stade d'une cellule. L'AUG-MO cible le codon d'initiation et, par conséquent, inhibe à la fois un message de Wnt5a maternelle et zygotique. L'épissure-MO vise le troisième site donneur d'épissage et inhibe seulement la transcription zygotique de Wnt5a (figure 1A). Le août-…

Discussion

Polykystose rénale (PKD) est l'une des principales causes de maladie rénale terminale chez l'homme et est caractérisée par la formation progressive d'un kyste, l'élargissement rénale, et le développement des tubules anormale ^14. PKD autosomique dominante (ADPKD) est une maladie génétique dans laquelle une ou l'autre mutation de PKD1, codant pour la polycystine-1 (PC1) ou PKD2, codant pour la polycystine-2 (PC2), les résultats dans les reins polykystiques. Beaucoup d'autres g?…

Materials

0.5% Phenol-Red	Sigma	P0290	Color indicator for injection
Morpholino	Genn Tools, LLC	(customized)	Customized designed to the gene of interest
Pre-pulled needle	Tritech Research	MINJ-PP	If large amount of needle is required, you can also purchase a needle puller and prepare the needle in the lab
T7 mMessage Kit	Ambion	1344	For in vitro transcription to make capped mRNA for rescue experiment
N-Phenylthiourea	Sigma	P7629	For prevention of melanization
Tricaine	Sigma	A5040	Also called ethyl 3-aminobenzoate, for zebrafish anesthesia
Methyl Cellulose	Sigma	M-0387	For position of zebrafish
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	For purification of PCR product for cap RNA synthesis.
dNTP mix	Promega	U1511	For PCR
Tag DNA Polymerase	Invitrogen	10342-053	For PCR
Equipment
NanoDrop sepctrophotometer	Thermo Scientific	ND-1000	For measure morpholino and RNA concentration
Air Compressor	Werther International, Inc.	Panther Compact 106	Air source for injection
Pico micro-injection pump	World Precision Instruments Inc	PV830 Pnematic PicoPump	Other types of microinjection system can be used.
Micro-manuplator	World Precision Instruments Inc	MMJR	Right-handed (MMJL for left handed)
Needle holder	World Precision Instruments Inc	5430-ALL	To hold needle for micromanipulation
Dumont Tweezers	Fine Surgical Tools	11253-20	For breaking off the needle tip
Dissecting microscope	Leica M205C		For observing and imaging zebrafish embryos
Fluorscence microscope	Zeiss Axio Obserer D1m		For imaging zebrafish pronephros
Capillary tube (I.D 0.15 mm)	VitroCom	CV1525Q-100	For measure the volume of each injected drop