Um Modelo Possível Zebrafish da doença renal policística: Knockdown de<em> Wnt5a</em> Faz com cistos no peixe-zebra Rins

Summary

We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.

Abstract

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG – and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to “off-target” effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.

Introduction

Peixe-zebra (Danio rerio) embriões têm sido amplamente utilizados como um modelo para estudar o desenvolvimento renal e doença renal policística. Há muitas vantagens na utilização do peixe-zebra como um modelo animal: a viabilidade de estudar interacções genéticas, a capacidade de usar morpholinos anti-sentido (MO) para knockdown proteína, a oportunidade para ensaiar rapidamente um grande número de embriões, e a facilidade de visualização de órgãos em fenótipos ¹ larvas vivas. Os pronephros é o primeiro rim para desenvolver nos vertebrados e é funcional em peixes-zebra larval ^2. A estrutura dos pronephros peixe-zebra é relativamente simples quando comparado com os metanefros de mamífero, o terceiro e último rim para desenvolver em mamíferos. O néfron é a unidade de trabalho do rim, com cada rim humano que contenham entre 500,000-1,000,000 néfrons ^3,4 e cada rim do rato tendo aproximadamente 13.000 néfrons ^5, o que torna difícil observar a estrutura de néfrons único in rins humanos ou do mouse. O peixe-zebra tem apenas dois nefrónios, cada nefrónio peixe-zebra e contém todos os componentes principais encontrados nos glomérulos e túbulos de ratos e seres humanos ⁶ e tipos de células renais especializadas semelhantes. Comparado a outros modelos de vertebrados, como Xenopus, o néfron zebrafish mais se assemelha a de néfrons mamíferos porque tem um sistema fechado ^7.

Nos últimos anos, o genoma do peixe-zebra foi sequenciado, permitindo a ampla introdução de ferramentas genéticas, amplos recursos mutantes, e coleções de linhas repórter transgênicos em modelos de peixe-zebra. Os peixes-zebra pronephros formas entre 12-72 h pós fertilização (hpf) e podem ser facilmente visualizados em embriões transparentes. Proteína tumor do Wilm WT1 é um fator essencial para o desenvolvimento do rim. Linhas de peixes-zebra transgénicos que expressam a proteína fluorescente verde (GFP) sob o controlo do promotor wt1b Tg (wt1b: GFP) mostram GFP expression especificamente localizados em regiões pronephric em embriões de peixe-zebra, a partir de 17 hpf ^8. Nephronophthisis (NPHP), uma doença do rim autossómica recessiva cística, é causada por mutações de genes NPHP ^9. NPHP4 knockdown por morfolino causou a formação de cistos na Tg (wt1b: GFP). Fish ¹⁰ Portanto, este peixe transgênico é um modelo adequado para a observação de estruturas renais e formação de cistos durante o desenvolvimento do rim. Importante, a influência de moduladores de desenvolvimento do rim pode ser estudada usando esta estirpe em um tempo de trabalho e modo eficiente.

Nosso trabalho descreve o uso de Tg (wt1b: GFP) de peixe como um modelo para visualizar a formação de cistos nos rins depois de modulação gene. Usamos partida e emenda local anti-sense MOs derrubar o gene Wnt5a no peixe-zebra. Wnt5a é uma glicoproteína segregada não canónicas da família Wnt, que desempenha um papel importante no desenvolvimento de vários órgãos e pós-natal celularfunção ^11. Wnt5a funciona através de vias de Wnt não canónicas, incluindo a via de polaridade celular planar (PCP), que tem sido encontrado para desempenhar um papel na divisão celular orientada durante o alongamento tubular renal. Wnt5a regula a via Wnt / PCP, formando um complexo com o receptor de tirosina cinase semelhante (Ryk), que transduz mais Wnt5a sinalização através da formação de um complexo com a proteína da polaridade celular planar VANGL 2 (Vangl2), promovendo assim a estabilidade Vangl2 ^12. Os defeitos na via de PCP pode resultar na divisão celular aleatória e causar a formação de quistos renais. Utilizou-se o Tg (wt1b: GFP) linha peixe-zebra para observar a formação de cistos nos rins seguinte Wnt5a knockdown. A Tg (wt1b: GFP) modelo de peixe-zebra permite imagens ao vivo e observação oportuna da estrutura renal. Após Wnt5a knockdown, formação de cistos nos rins foi encontrado com início às 24 hpf; a 72 hpf, os cistos podem ser encontrados nos glomérulos e dos túbulos proximais. Este método também poderia ser usado para screen outros genes que podem causar a formação de cistos nos rins.

Protocol

Declaração de Ética: NOTA: Todas as experiências de peixe-zebra foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso do animal Institucional da Eastern Virginia Medical School. 1. Preparação Morpholino Concepção e síntese de tradução-bloqueio (AUG-) e de inibição de splicing (Splice-) morfolino anti-sentido (MO) oligonucleótidos para o gene de interesse, conforme as instruções do fabricante (Figura 1A). Por favor, consulte as informações do fabricante na Tabela 1.<…

Representative Results

Wnt5a derrubar foi conseguido através da introdução de tradução bloqueando MO (AUG-MO) ou exon / intron fronteira emenda MO (tala-MO) para embriões de peixes-zebra no estádio de uma célula. O AUG-MO tem como alvo o codão de iniciação e, portanto, inibe tanto a mensagem Wnt5a materna e zigótica. A tala MO-alvo o terceiro local de splice dador e inibe apenas a transcrição zigótica de Wnt5a (Figura 1A). O AUG- e morphants splice- phenocopied uns aos outros com defeitos múl…

Discussion

Doença policística dos rins (PKD) é uma das principais causas da doença renal da fase final em seres humanos e é caracterizada pela formação progressiva cisto, o alargamento renal e desenvolvimento anormal túbulo ^14. Autossómica dominante de PKD (ADPKD) é uma doença genética em que a mutação de qualquer um de PKD1, que codifica policistina-1 (CP1), ou PKD2, que codifica policistina-2 (PC2), resulta em doença renal policística. Muitos outros genes, especialmente aqueles que codificam proteínas…

Materials

0.5% Phenol-Red	Sigma	P0290	Color indicator for injection
Morpholino	Genn Tools, LLC	(customized)	Customized designed to the gene of interest
Pre-pulled needle	Tritech Research	MINJ-PP	If large amount of needle is required, you can also purchase a needle puller and prepare the needle in the lab
T7 mMessage Kit	Ambion	1344	For in vitro transcription to make capped mRNA for rescue experiment
N-Phenylthiourea	Sigma	P7629	For prevention of melanization
Tricaine	Sigma	A5040	Also called ethyl 3-aminobenzoate, for zebrafish anesthesia
Methyl Cellulose	Sigma	M-0387	For position of zebrafish
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	For purification of PCR product for cap RNA synthesis.
dNTP mix	Promega	U1511	For PCR
Tag DNA Polymerase	Invitrogen	10342-053	For PCR
Equipment
NanoDrop sepctrophotometer	Thermo Scientific	ND-1000	For measure morpholino and RNA concentration
Air Compressor	Werther International, Inc.	Panther Compact 106	Air source for injection
Pico micro-injection pump	World Precision Instruments Inc	PV830 Pnematic PicoPump	Other types of microinjection system can be used.
Micro-manuplator	World Precision Instruments Inc	MMJR	Right-handed (MMJL for left handed)
Needle holder	World Precision Instruments Inc	5430-ALL	To hold needle for micromanipulation
Dumont Tweezers	Fine Surgical Tools	11253-20	For breaking off the needle tip
Dissecting microscope	Leica M205C		For observing and imaging zebrafish embryos
Fluorscence microscope	Zeiss Axio Obserer D1m		For imaging zebrafish pronephros
Capillary tube (I.D 0.15 mm)	VitroCom	CV1525Q-100	For measure the volume of each injected drop