Die Handhabung der Baumwolle Ratte in Studien für die präklinische Bewertung onkolytischer Viren
Summary
Cotton rats are extremely excitable and have a strong flight-or-fight response. A handling method optimized to reduce the stress of the animals is described which will make cotton rats more accessible as a preclinical model.
Abstract
Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact. For this strategy to be successful, recent studies have shown that involvement of the host immune system is essential. Therefore, oncolytic virotherapy should be evaluated within the context of an immunocompetent model. Furthermore, the study of antitumor therapies in tolerized animal models may better recapitulate results seen in clinical trials. Cotton rats, commonly used to study respiratory viruses, are an attractive model to study oncolytic virotherapy as syngeneic models of mammary carcinoma and osteosarcoma are well established. However, there is a lack of published information on the proper handling procedure for these highly excitable rodents. The handling and capture approach outlined minimizes animal stress to facilitate experimentation. This technique hinges upon the ability of the researcher to keep calm during handling and perform procedures in a timely fashion. Finally, we describe how to prepare cotton rat mammary tumor cells for consistent subcutaneous tumor formation, and how to perform intratumoral and intraperitoneal injections. These methods can be applied to a wide range of studies furthering the development of the cotton rat as a relevant pre-clinical model to study antitumor therapy.
Introduction
Onkolytischer Viren (OV) selektiv in Tumorzellen zu replizieren, indem biochemische Unterschiede zwischen normalen und Tumorzellen 1,2. Es gibt zwei Arten von OVs: solche, die keine Mutation an selektiven Onkolyse zu erreichen, die als natürlich vorkommende Wildtyp-Viren und solche, die dazu entworfen sind, um eine selektive Onkolyse erzielen. Die Sammlung von Mutationen in einem bestimmten Tumortyp bestimmt die Art der selektiven Wachstumsvorteil gegenüber normalen Zellen für eine OV 2. Die Sicherheit und der Vorteil der Verwendung OVs wurde in klinischen Studien 3-7 gezeigt. Trotz Fortschritten auf dem Gebiet der onkolytischen Virotherapie existieren Lücken zwischen präklinischen und klinischen Ergebnissen, was darauf hindeutet, dass eine bessere Modelle werden benötigt, um die Antitumor-Wirksamkeit von OVs bewerten.
Bovine Herpesvirus Typ 1 (BHV-1) ist ein Mitglied der Familie Herpesviridae und Alphaherpesviridae Subfamilie. BHV-1 initiates Atemwegserkrankungen beim Rind Komplex bei Rindern, manifestiert sich in einer Vielzahl von Symptomen ähnlich einer Erkältung 8,9. BHV-1 bindet durch HSV-1 verwendet Befestigung und Eintrittsrezeptoren, wie Heparansulfat und Nectin-1 10. Jedoch bindet CD155 an die Stelle der Nectin-2 10. BHV-1 hat einen sehr engen Wirtsbereich, so dass er nicht in der Lage, effizient ein und initiiert die Replikation in normalen und transformierten Mäusezellen 3,4,10 ist. Dies macht den Einsatz von herkömmlichen murinen Modellen problematisch. Onkolytisches Kapazität von BHV-1 wurde in vitro 11,12 nachgewiesen. BHV-1 wurde gezeigt, dass die Replikation in einer Vielzahl von histologischen Ursprungs, einschließlich Brustkrebszellen und Brustkrebszellen initiieren 11,12 initiieren und zu töten menschlichen Tumorzellen. Jedoch muss die Antitumor Kapazität von BHV-1 in vivo im Kontext eines immunkompetenten Wirts ausgewertet werden.
Menschliche Adenovirus (Ad), für welcheEs gibt 57 identifizierte Serotypen, am häufigsten verursacht Atemwegserkrankungen beim Menschen. Onkolytischen Ad-Vektoren wurden für ihre Antitumorwirksamkeit mit mehreren fort in klinischen Studien 13 bis 15 bewertet worden. Trotz vielversprechender präklinischer Daten haben klinische Ergebnisse hinter den Erwartungen zurück. Menschliche Tumor Xenotransplantatmodellen werden typischerweise verwendet, um die Antitumor-Wirksamkeit von Ad Vektoren zu untersuchen, obwohl zeigen sie abgeschwächt Immunreaktionen auf den Virus 16,17. Darüber hinaus sind syngenen Mausmodell nicht-permissiven zur Ad-Infektion, so dass die Auswertung der Wirtsimmunreaktionen mit diesen Modellen unpraktisch 17,18.
Der Host-Immunsystem als der einflussreichste Mechanismus, durch den OVs entlocken Tumorzelltod 19 identifiziert. Antitumor-Antworten zwischen tolerierten und nicht-tolerierten Tumor-assoziiertes Antigen (TAA) Modelle unterscheiden und kann stark Einfluss auf den Erfolg der OV-Therapie. Das HSV-1 OV KM100 (ICP0 N212VP16 1814 20) 20,21 ausgelöst Tumorrückgang bei 80% der tumortragenden Mäusen in einem murinen Polyoma Mittel T-Antigen Brustkrebsmodell 22. Doch in HER-2 / neu-Modelle, die Antitumor-Wirksamkeit von KM100 variiert zwischen 20% vollständige Regression in syngenen Mäusen und Tumor Stase in transgenen, HER2-toleranten Mäusen. Zusammen stellen diese Daten unterstreichen die Bedeutung einer vollständigen Auswertung OVs anhand von Tiermodellen, die am besten zu rekapitulieren das menschliche Immunsystem Landschaft zu verstehen, welche Funktionen bestimmen den Therapieerfolg.
Die Baumwollratte (Sigmodon hispidus), heimisch in Nord- und Südamerika, wird am häufigsten als ein Modell der RS-Virus-Infektion (wie in 5 überprüft). Baumwollratten sind auch in anti-BHV-1-Impfung Forschung verwendet, da sie die Pathologie, die mit Atemwegserkrankungen beim Rind komplexen 6,23 verbunden rekapitulieren. Weiterhin BHV-1-Infektion von Baumwollrattenimmunogen und induziert anhalt Schleimhaut und systemische Immunreaktionen 6,23-25. Zelllinien wurden aus spontanen Fibrosarkom und Osteosarkom der Brustdrüse (LCRT) und Knochen (CCRT und VCRT) bzw. 26 abgeleitet. Baumwollratten wurden verwendet, um die in vivo Wirksamkeit von onkolytischen Ad Vektoren zu bewerten, da sie anfällig für Ad-Infektion sind und eine ähnliche Pathologie an Menschen 27-29. Die Verwendung von immun Modelle für die präklinische Bewertung OVS sind nicht nur weniger anzeigt klinische Ansprechen auf die Therapie, aber sie berücksichtigen nicht die Rolle des Immunsystems bei onkolytischen Virotherapie 30,31 statt. Daher ist die syngene Tumor tolerisiert Baumwollrattenmodell des Mammakarzinoms und Osteosarkom relevant sind Modelle, in denen die präklinische Wirksamkeit OVs wie BHV-1 und Ad die unter Verwendung herkömmlicher Mausmodellen nicht untersucht werden können, zu bewerten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cotton rats are highly excitable and have a strong flight response. Therefore, special care should be taken to minimize any undue stress on the animal. The cage setup described will allow for safe and easy capture of the animals, with the placement of the enrichment tube being of the utmost importance. When setting up cages, ensure that the enrichment tubes meet the size and shape requirements, and are placed in proper orientation in the cage. It is also important to ensure that any technicians who might be aiding in ani…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Breanne Cuddington holds a fellowship from the Canadian Breast Cancer Foundation. This work was sponsored by operating grants from the Cancer Research Society and the Canadian Cancer Society Research Institute (formerly the Canadian Breast Cancer Research Alliance). We thank Ann Tollefson (Saint Louis University School of Medicine) for LCRT cells and Dr. Kathleen Delaney and Marion Corrick for technical assistance with cotton rat housing and sedation.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog # | Comments/Description |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Gibco | 11965-092 | May use any brand |
| 1X Phosphate Buffered Saline | Can prepare in lab, filter to sterilize | ||
| 200 mM L-glutamine | Gibco | 25030164 | May use any brand |
| 100x Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | May use any brand |
| Fetal bovine serum | Quality Biological Inc. | 110-001-101HI | May use any brand |
| T-150cm2 tissue culture flask | Fisher Scientific | 14-826-80 | May use any brand |
| 1X TypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | |
| 12-well cell culture plate, flat bottom | Fisher Scientific | 08-772-29 | May use any brand, must be tissue culture treated |
| alamarBlue | Life Technologies | DAL1025 | May use an alternative reagent for determination of cell viability |
| 8640 Teklad 22/5 Rodent diet | Harlan | 8640 | |
| 1/8” corncob rodent bedding | Harlan | 7092 | |
| Nestlets | Ancare | – | Made of pulped virgin cotton fiber, dust-free and autoclavable |
| 50 mL Conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | May use any brand, must be sterile |
| Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | M60302 | |
| 70% Ethanol | Can prepare in lab | ||
| 10 % Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | May use any brand |
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog # | Comments/Description |
| NAPCO NapFlow 1200 Class II A/B3 Biosafety Microbiological Safety Cabinet (cell culture hood) | NAPCO | Model used not currently available | May use any brand |
| Thermo Fisher Scientific Precision Heated Water Bath | Fisher Scientific | Model used not currently available | May use any brand |
| Reichert Bright-line Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | May use any brand |
| Typhoon Trio BioAnalyzer | GE Healthcare Life Sciences | Model used not currently available | May use any fluorescence plate reader |
| Tecan Safire2 Multi-detection Microplate Reader | Tecan | Model used not currently available | May use any fluorescence plate reader |
| Allegra 6R benchtop centrifuge | Beckman Coulter | 366816 | May use any brand |
| Table Top Anaesthesia machine | VetEquip | Model used not currently available | May use any brand, must be portable |
| Wahl Peanut Mini Clippers | Wahl | May use any brand of small clippers | |
| Insulin syringes 29 G x 1/2', 0.3 mL | BD | 329464 | May use any brand. Insulin syringes are recommended as they make injections easier through the rat’s tough skin. |
| Cotton swabs | MedPro | 018-425 | May use any brand |
| Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 8940 | May use any brand |
| Dissecting Tissue Forceps | Fisher Scientific | 13-812-41 | May use any brand |
References
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