Manipolazione del Cotton Rat in studi per la valutazione pre-clinica di oncolitici virus

Summary

Cotton rats are extremely excitable and have a strong flight-or-fight response. A handling method optimized to reduce the stress of the animals is described which will make cotton rats more accessible as a preclinical model.

Abstract

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact. For this strategy to be successful, recent studies have shown that involvement of the host immune system is essential. Therefore, oncolytic virotherapy should be evaluated within the context of an immunocompetent model. Furthermore, the study of antitumor therapies in tolerized animal models may better recapitulate results seen in clinical trials. Cotton rats, commonly used to study respiratory viruses, are an attractive model to study oncolytic virotherapy as syngeneic models of mammary carcinoma and osteosarcoma are well established. However, there is a lack of published information on the proper handling procedure for these highly excitable rodents. The handling and capture approach outlined minimizes animal stress to facilitate experimentation. This technique hinges upon the ability of the researcher to keep calm during handling and perform procedures in a timely fashion. Finally, we describe how to prepare cotton rat mammary tumor cells for consistent subcutaneous tumor formation, and how to perform intratumoral and intraperitoneal injections. These methods can be applied to a wide range of studies furthering the development of the cotton rat as a relevant pre-clinical model to study antitumor therapy.

Introduction

Virus oncolitici (OV) replicano selettivamente nelle cellule tumorali sfruttando differenze biochimiche tra cellule normali e tumorali ^1,2. Ci sono due tipi di VU: quelli che non necessitano di una mutazione per raggiungere oncolisi selettivo, denominato naturalmente allo wild-type virus e quelli che devono essere progettati per ottenere oncolisi selettiva. La collezione di mutazioni all'interno di un determinato tipo di tumore determina la natura del vantaggio di crescita selettiva su cellule normali per OV ^2. La sicurezza e vantaggio di utilizzare VU è stata dimostrata in studi clinici ^3-7. Nonostante i progressi nel campo della viroterapia oncolytic esistono spazi vuoti tra i risultati pre-clinici e clinici, suggerendo che i modelli migliori sono necessari per valutare l'efficacia antitumorale di VU.

Bovine herpesvirus 1 (BHV-1) è un membro della famiglia Herpesviridae, e Alphaherpesviridae sottofamiglia. BHV-1 initiAtes bovina complesso malattie respiratorie nei bovini, manifestando in una grande varietà di sintomi che assomiglia ad un brutto raffreddore ^8,9. BHV-1 si lega fissaggio e ingresso recettori utilizzati da HSV-1, come eparan solfato e nectin-1 ^10. Tuttavia, si lega CD155 nel luogo di nectin-2 ^10. BHV-1 ha una gamma di ospiti molto ristretta tale che sia in grado di entrare e avviare la replica in cellule murine normali e trasformate ^3,4,10 efficiente. Questo rende l'uso di modelli murini convenzionali problematico. La capacità di oncolytic BHV-1 è stata dimostrata in vitro ^11,12. BHV-1 ha dimostrato di avviare la replica e uccidere le cellule tumorali umane da una varietà di origini istologici, comprese le cellule del cancro al seno e il cancro al seno avvio cellule ^11,12. Tuttavia, la capacità antitumorale di BHV-1 deve essere valutata in vivo nel contesto di un ospite immunocompetente.

Adenovirus umano (Ad), per il qualeci sono 57 sierotipi identificati, più comunemente provoca malattie respiratorie negli esseri umani. Ad vettori oncolitici sono stati valutati per la loro efficacia antitumorale con diversi avanzare in studi clinici ^13-15. Nonostante i dati pre-clinici promettenti, i risultati clinici sono stati inferiori alle aspettative. Modelli xenotrapianto di tumori umani sono in genere utilizzati per studiare l'efficacia antitumorale di vettori Ad, anche se esibiscono attenuate le risposte immunitarie al virus ^16,17. Inoltre, i modelli murini singenici sono non-permissive all'infezione annuncio, rendendo la valutazione della risposta immunitaria con questi modelli impraticabile ^17,18.

Il sistema immunitario dell'ospite è stato identificato come il meccanismo più influente attraverso il quale VU suscitano tumorali morte cellulare ^19. Risposte antitumorali tra tolleranti e l'antigene associato al tumore non-tolleranti (TAA) modelli differiscono e possono influenzare notevolmente il successo della terapia OV. L'HSV-1 OV KM100 (ICP0 ^N212VP16 ^{nel 1814 20) 20,21} suscitato regressione del tumore nel 80% dei topi portatori di tumore in un murino antigene Polyoma Medio T modello di cancro mammario ^22. Tuttavia, in HER-2 modelli / neu, l'efficacia antitumorale di KM100 variava tra il 20% completa regressione nei topi singenici e tumore stasi transgenici, topi HER2-tolleranti. Insieme, questi dati evidenziano l'importanza di valutare pienamente VU utilizzando modelli animali che meglio ricapitolano il paesaggio immunitario umano per comprendere appieno le caratteristiche che determinano il successo terapeutico.

Il ratto di cotone (Sigmodon hispidus), indigeni del Nord e Sud America, è più comunemente usato come modello di infezione da virus respiratorio sinciziale (come rivisto in ^5). Ratti di cotone sono utilizzati anche in-BHV-1 contro la ricerca di vaccinazione come ricapitolano la patologia associata a malattia respiratoria bovina complessa ^6,23. Inoltre, BHV-1 infezione di ratti di cotoneè immunogenico, inducendo mucosa sostenuta e risposte immunitarie sistemiche ^6,23-25. Le linee cellulari sono stati derivati ​​da fibrosarcoma spontanea e osteosarcomi della ghiandola mammaria (LCRT) e ossa (CCRT e VCRT), rispettivamente, ^26. Cotone ratti sono stati utilizzati per valutare l'efficacia in vivo di vettori Ad oncolytic come sono suscettibili all'infezione annuncio ed esporre patologia simile all'uomo ^27-29. L'uso di modelli immunocompromessi per la valutazione pre-clinica di VU non sono solo meno indicativo di risposte cliniche alla terapia ma non tengono conto del ruolo del sistema immunitario in viroterapia oncolitica ^30,31. Pertanto, la singenici e modelli tumorali cotone ratto-tolleranti di carcinoma mammario e osteosarcoma sono modelli pertinenti a cui valutare l'efficacia pre-clinica di VU, quali BHV-1 e Ad che non può essere studiata utilizzando modelli murini convenzionali.

Protocol

NOTA: I protocolli utilizzati sono stati approvati dal nostro istituzionale Animal Research Ethics Consiglio della McMaster University in base al Canadian sugli orientamenti per la cura degli animali. Gli esperimenti sono stati condotti presso l'impianto di McMaster University Central Animal. 1. Le celle Culturing LCRT Cellule Culture LCRT in terreno Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-glutammina, 100 U / ml di pen…

Representative Results

A causa della natura estremamente eccitabile di ratti cotone, essendo a conoscenza e utilizzando procedure ottimizzate per ridurre lo stress degli animali faciliterà nel loro uso come modello animale preclinico. L'uso di tecniche di manipolazione anche minimizzare i rischi per il ricercatore. Quando si utilizzano topi cotone è indispensabile per mantenere la calma. I ratti sono altamente eccitabile e tenteranno di sfuggire alla loro gabbia. L'uso di un tubo di arricchimento e nestl…

Discussion

Cotton rats are highly excitable and have a strong flight response. Therefore, special care should be taken to minimize any undue stress on the animal. The cage setup described will allow for safe and easy capture of the animals, with the placement of the enrichment tube being of the utmost importance. When setting up cages, ensure that the enrichment tubes meet the size and shape requirements, and are placed in proper orientation in the cage. It is also important to ensure that any technicians who might be aiding in ani…

Materials

Name of Material/Equipment	Company	Catalog #	Comments/Description
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Gibco	11965-092	May use any brand
1X Phosphate Buffered Saline			Can prepare in lab, filter to sterilize
200 mM L-glutamine	Gibco	25030164	May use any brand
100x Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062	May use any brand
Fetal bovine serum	Quality Biological Inc.	110-001-101HI	May use any brand
T-150cm2 tissue culture flask	Fisher Scientific	14-826-80	May use any brand
1X TypLE Express	Life Technologies	12604-013
12-well cell culture plate, flat bottom	Fisher Scientific	08-772-29	May use any brand, must be tissue culture treated
alamarBlue	Life Technologies	DAL1025	May use an alternative reagent for determination of cell viability
8640 Teklad 22/5 Rodent diet	Harlan	8640
1/8” corncob rodent bedding	Harlan	7092
Nestlets	Ancare	–	Made of pulped virgin cotton fiber, dust-free and autoclavable
50 mL Conical tubes	Fisher Scientific	14-432-22	May use any brand, must be sterile
Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	M60302
70% Ethanol			Can prepare in lab
10 % Neutral Buffered Formalin	Sigma-Aldrich	HT501128	May use any brand
Name of Material/Equipment	Company	Catalog #	Comments/Description
NAPCO NapFlow 1200 Class II A/B3 Biosafety Microbiological Safety Cabinet (cell culture hood)	NAPCO	Model used not currently available	May use any brand
Thermo Fisher Scientific Precision Heated Water Bath	Fisher Scientific	Model used not currently available	May use any brand
Reichert Bright-line Hemacytometer	Sigma-Aldrich	Z359629	May use any brand
Typhoon Trio BioAnalyzer	GE Healthcare Life Sciences	Model used not currently available	May use any fluorescence plate reader
Tecan Safire2 Multi-detection Microplate Reader	Tecan	Model used not currently available	May use any fluorescence plate reader
Allegra 6R benchtop centrifuge	Beckman Coulter	366816	May use any brand
Table Top Anaesthesia machine	VetEquip	Model used not currently available	May use any brand, must be portable
Wahl Peanut Mini Clippers	Wahl		May use any brand of small clippers
Insulin syringes 29 G x 1/2', 0.3 mL	BD	329464	May use any brand. Insulin syringes are recommended as they make injections easier through the rat’s tough skin.
Cotton swabs	MedPro	018-425	May use any brand
Sharp-Pointed Dissecting Scissors	Fisher Scientific	8940	May use any brand
Dissecting Tissue Forceps	Fisher Scientific	13-812-41	May use any brand