Håndtering av Cotton Rat i studier for de prekliniske Evaluering av Onkolytiske virus

Summary

Cotton rats are extremely excitable and have a strong flight-or-fight response. A handling method optimized to reduce the stress of the animals is described which will make cotton rats more accessible as a preclinical model.

Abstract

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact. For this strategy to be successful, recent studies have shown that involvement of the host immune system is essential. Therefore, oncolytic virotherapy should be evaluated within the context of an immunocompetent model. Furthermore, the study of antitumor therapies in tolerized animal models may better recapitulate results seen in clinical trials. Cotton rats, commonly used to study respiratory viruses, are an attractive model to study oncolytic virotherapy as syngeneic models of mammary carcinoma and osteosarcoma are well established. However, there is a lack of published information on the proper handling procedure for these highly excitable rodents. The handling and capture approach outlined minimizes animal stress to facilitate experimentation. This technique hinges upon the ability of the researcher to keep calm during handling and perform procedures in a timely fashion. Finally, we describe how to prepare cotton rat mammary tumor cells for consistent subcutaneous tumor formation, and how to perform intratumoral and intraperitoneal injections. These methods can be applied to a wide range of studies furthering the development of the cotton rat as a relevant pre-clinical model to study antitumor therapy.

Introduction

Onkolytiske virus (OV) selektivt å replikere i tumorceller ved å utnytte biokjemiske forskjeller mellom normale og tumorceller ^1,2. Det er to typer av OVS: de som ikke krever en mutasjon for å oppnå selektiv oncolysis, referert til som naturlig forekommende vill-type virus og de som må være konstruert for å oppnå selektiv oncolysis. Samlingen av mutasjoner innenfor et gitt tumortype bestemmer arten av den selektive vekst fordel i forhold til normale celler til et ^OV-2. Den sikkerhet og nytte av hjelp OVS har blitt vist i kliniske studier ^3-7. Til tross for fremskritt innen onkolytisk virotherapy det finnes gap mellom pre-kliniske og kliniske resultater, noe som tyder på at bedre modeller for å evaluere antitumor effekt av OVS.

Bovine herpesvirus type 1 (BHV-1) er et medlem av Herpesvirus familien, og Alphaherpesviridae underfamilie. BHV-1 tt ig ngater luftveiene hos storfe kompleks i storfe, manifestere i et bredt spekter av symptomer som ligner en dårlig kald ^8,9. BHV-1 binder feste- og inngangs reseptorer som brukes av HSV-1, slik som heparansulfat og nectin-1 ^10. Men binder det CD155 i stedet for nectin-2 ^10. BHV-1 har et meget snevert vertsområde, slik at det er i stand til effektivt å legge inn og initiere replikasjon i normale og transformerte museceller ^3,4,10. Dette gjør bruk av konvensjonelle murine modeller problematisk. Den onkolytisk kapasitet på BHV-1 har blitt vist in vitro ^11,12. BHV-1 har blitt vist å initiere replikasjon i og drepe humane tumorceller fra en rekke histologiske opprinnelse, inkludert brystkreft celler og brystkreft initiere celler ^11,12. Imidlertid må antitumor kapasitet på BHV-1 bli evaluert in vivo i forbindelse med en immunkompetente vert.

Menneskelig Adenovirus (Ad), somDet er 57 identifisert serotyper, oftest forårsaker respiratorisk sykdom hos mennesker. Onkolytiske Ad vektorer har blitt evaluert for sin antitumor effekt med flere fremmarsj i kliniske studier ^13-15. Til tross for lovende pre-kliniske data, har kliniske resultater falt kort av forventningene. Menneskelig svulst xenograft modeller er vanligvis brukes til å studere antitumor effekt av Ad vektorer, selv om de viser svekket immunresponser mot viruset ^16,17. Videre syngene murine modeller er umottagelige til Ad infeksjon, noe som gjør evaluering av vertsimmunresponser ved hjelp av disse modellene upraktisk ^17,18.

Vertens immunsystemet har blitt identifisert som den mest innflytelsesrike mekanismen som OVS lokke fram tumorcelledød ^19. Antitumor respons mellom toleriserte og ikke-toleriserte tumorassosiert antigen (TAA) modellene skiller og kan i stor grad påvirke suksessen av OV terapi. HSV-1 OV KM100 (ICP0 ⁿ²¹²VP16 ^{i 1814 20) 20,21} fremkalte tumor regresjon i 80% av tumorbærende mus i en muse Polyoma Middle T antigen jursvulster modell ^22. Men i HER-2 / neu-modeller, den antitumor effekt av KM100 variert mellom 20% komplett regresjon i syngene mus og svulst stasis i transgene, HER2-toleriserte mus. Sammen disse dataene markere betydningen av fullt evaluere OVS bruker dyremodeller som best rekapitulere menneskets immun landskapet å fullt ut forstå hvilke funksjoner bestemme terapeutisk suksess.

Bomullen rotte (Sigmodon hispidus), innfødt til Nord-og Sør-Amerika, er mest brukt som en modell av respiratorisk syncytialt virus infeksjon (som anmeldt i ^5). Bomullsrotter blir også brukt i anti-BHV-1 vaksinasjon forskning som de rekapitulere patologien forbundet med bovin respiratorisk sykdom kompleks ^6,23. Videre BHV-1-infeksjon av bomullsrotterer immunogent, indusere vedvarende slimhinne og systemiske immunresponser ^6,23-25. Cellelinjer er avledet fra spontan fibrosarcoma og osteosarkomer av melkekjertlene (LCRT) og bein (CCRT og VCRT), henholdsvis ^26. Bomullsrotter har blitt brukt for å evaluere in vivo effekt av onkolytiske Ad vektorer som de er utsatt for Ad-infeksjon og oppviser lignende patologi for mennesker ^27-29. Bruken av immunkompromitterte modeller for pre-klinisk evaluering av OVS er ikke bare mindre indikerer kliniske respons på behandling, men som ikke tar hensyn til den rolle i immunsystemet i onkolytisk virotherapy ^30,31. Derfor syngenisk og tumor-toleriserte bomullsrottemodeller av brystkreft og osteosarkom er relevante modeller som å evaluere pre-kliniske effekten av OVS, slik som BHV-1 og Ad, som ikke kan studeres ved hjelp av konvensjonelle murine modeller.

Protocol

MERK: De protokollene som brukes er godkjent av vår institusjonelle Animal forskningsetikk styret ved McMaster University ifølge Canadian Council on Animal Care retningslinjer. Forsøkene ble utført ved McMaster University Central Animal Facility. 1. Dyrking LCRT Cells Kultur LCRT celler i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin. Opprettholde celler i T-150 …

Representative Results

På grunn av den ekstremt hissige natur bomull rotter, blir kjent med og utnytte prosedyrer optimalisert for å redusere stress av dyrene vil lette i sin bruk som en pre-klinisk dyremodell. Bruk av riktig håndtering teknikker vil også minimere risiko for forskeren. Når du bruker bomulls rotter er det viktig å holde seg rolig. Rottene er svært opphisset og vil forsøke å unnslippe sitt bur. Bruk av en berikelse rør og nestlets vil redusere rømningsforsøk. Figur 2 vis…

Discussion

Cotton rats are highly excitable and have a strong flight response. Therefore, special care should be taken to minimize any undue stress on the animal. The cage setup described will allow for safe and easy capture of the animals, with the placement of the enrichment tube being of the utmost importance. When setting up cages, ensure that the enrichment tubes meet the size and shape requirements, and are placed in proper orientation in the cage. It is also important to ensure that any technicians who might be aiding in ani…

Materials

Name of Material/Equipment	Company	Catalog #	Comments/Description
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Gibco	11965-092	May use any brand
1X Phosphate Buffered Saline			Can prepare in lab, filter to sterilize
200 mM L-glutamine	Gibco	25030164	May use any brand
100x Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062	May use any brand
Fetal bovine serum	Quality Biological Inc.	110-001-101HI	May use any brand
T-150cm2 tissue culture flask	Fisher Scientific	14-826-80	May use any brand
1X TypLE Express	Life Technologies	12604-013
12-well cell culture plate, flat bottom	Fisher Scientific	08-772-29	May use any brand, must be tissue culture treated
alamarBlue	Life Technologies	DAL1025	May use an alternative reagent for determination of cell viability
8640 Teklad 22/5 Rodent diet	Harlan	8640
1/8” corncob rodent bedding	Harlan	7092
Nestlets	Ancare	–	Made of pulped virgin cotton fiber, dust-free and autoclavable
50 mL Conical tubes	Fisher Scientific	14-432-22	May use any brand, must be sterile
Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	M60302
70% Ethanol			Can prepare in lab
10 % Neutral Buffered Formalin	Sigma-Aldrich	HT501128	May use any brand
Name of Material/Equipment	Company	Catalog #	Comments/Description
NAPCO NapFlow 1200 Class II A/B3 Biosafety Microbiological Safety Cabinet (cell culture hood)	NAPCO	Model used not currently available	May use any brand
Thermo Fisher Scientific Precision Heated Water Bath	Fisher Scientific	Model used not currently available	May use any brand
Reichert Bright-line Hemacytometer	Sigma-Aldrich	Z359629	May use any brand
Typhoon Trio BioAnalyzer	GE Healthcare Life Sciences	Model used not currently available	May use any fluorescence plate reader
Tecan Safire2 Multi-detection Microplate Reader	Tecan	Model used not currently available	May use any fluorescence plate reader
Allegra 6R benchtop centrifuge	Beckman Coulter	366816	May use any brand
Table Top Anaesthesia machine	VetEquip	Model used not currently available	May use any brand, must be portable
Wahl Peanut Mini Clippers	Wahl		May use any brand of small clippers
Insulin syringes 29 G x 1/2', 0.3 mL	BD	329464	May use any brand. Insulin syringes are recommended as they make injections easier through the rat’s tough skin.
Cotton swabs	MedPro	018-425	May use any brand
Sharp-Pointed Dissecting Scissors	Fisher Scientific	8940	May use any brand
Dissecting Tissue Forceps	Fisher Scientific	13-812-41	May use any brand