Mesure de la dégradation de l'ARNm Tarifs en<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Utilisation<em> Rpb1-1</em> Les souches

Summary

Le niveau de l'état d'équilibre des ARNm spécifiques est déterminée par le taux de synthèse et de la décomposition de l'ARNm. Taux de dégradation de l'ARNm pangénomiques ou les taux d'ARNm spécifiques de désintégration peuvent être mesurés en déterminant ARNm demi-vies. Ce protocole met l'accent sur ​​la mesure du taux d'ARNm de désintégration dans Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

les niveaux de l'état d'équilibre ARNm varient en fonction des conditions environnementales. La régulation des niveaux d'accumulation de l'état d'équilibre de l'ARNm de sorte que la quantité correcte de protéine est synthétisée dans des conditions de croissance spécifiques de la cellule. Une approche pour mesurer ARNm taux de décroissance est l'inhibition de la transcription et de suivi suite à la disparition de l'ARNm déjà présent. Le taux de dégradation de l'ARNm peut alors être quantifiée, et une demi-vie précise peut être déterminée en utilisant plusieurs techniques. Dans S. cerevisiae, des protocoles permettant de mesurer la demi-vie de l'ARNm ont été développés et comprennent l'inhibition de la transcription de l'ARNm en utilisant des souches abritant un allele sensible de l'ARN polymerase II, de rpb1-1 température. D'autres techniques de mesure de demi-vie de l'ARNm comprennent des inhibiteurs de la transcription de la transcription tels que thiolutine ou 1,10-phénanthroline, ou en variante, en utilisant des inhibiteurs de ARNm qui sont sous le contrôle d'un promoteur régulabletel que le promoteur inductible par le galactose et le système TET-off. Ici, nous décrivons la mesure de S. taux de décroissance cerevisiae ARNm en utilisant l'allèle sensible de l'ARN polymérase II de température. Cette technique peut être utilisée pour mesurer les taux d'ARNm des ARNm individuels ou l'ensemble du génome désintégration.

Introduction

La transcription et la décadence de l'ARNm spécifiques sont déterminants cruciaux de l'expression des gènes. Le taux de la synthèse et la décomposition des ARNm spécifiques détermine le niveau de cette ARNm particulier l'état d'équilibre. Les niveaux de l'état d'équilibre des ARNm régissent l'abondance d'ARNm et de déterminer combien de chaque ARNm est disponible pour la synthèse des protéines. Mesures de ARNm demi-vies sont largement utilisés pour déterminer le taux d'ARNm de décroissance. ARNm spécifique désintégration à des vitesses différentes qui sont liées aux caractéristiques de l'ARNm, la fonction de la protéine codée par l'ARNm et les conditions environnementales. Selon la technique utilisée pour déterminer les taux de NMD, les mesures de taux désintégration peuvent être déterminés soit globalement ou pour transcriptions des entretiens individuels. Dans la levure S. cerevisiae, les techniques les plus couramment utilisés pour mesurer les taux de NMD globale comprennent l'utilisation d'une souche de levure hébergeant l'allèle sensible de l'ARN polymérase II et transc chimique températureinhibiteurs riptional tels que thiolutine et 1,10-phénanthroline ^1-5. Ces méthodes peuvent également être utilisés pour mesurer les taux de NMD individuelle ^4. D'autres méthodes peuvent également être utilisés pour mesurer les taux d'ARNm de désintégration. Ces méthodes comprennent approche de l'étiquetage de l'état d'équilibre ou de l'utilisation de molécules d'ARNm qui sont exprimés à partir d'un promoteur régulé qui est exprimé uniquement dans certaines conditions. Chacune de ces techniques a des avantages et des limites. La technique décrite ici utilise l'allèle sensible de l'ARN polymérase II de la température. Cette méthode utilise S. cerevisiae comme modèle, mais peut être modifiée et utilisée dans d'autres systèmes utilisant des techniques d'inhibition de la transcription spécifiques ^6.

ARNm mesures demi-vie en utilisant l'allèle sensible de l'ARN polymérase II de température sont largement utilisés pour les deux mesures de l'ensemble du génome et individuels de la dégradation des ARNm ^4-5. Cette technique nécessite l'utilisation d'un spécific souche de levure qui abrite un allèle sensible de l'ARN polymérase II, de rpb1-1 ^une température. La justification de cette technique est que l'exposition de la souche de levure sensible de la température à la température non permissive inhibe la synthèse de l'ARNm. Par la suite, la décomposition de l'ARNm pré-existante est contrôlée à différents points de temps après la transcription a été inhibée. La disparition de l'ARNm pré-existante est contrôlée par extraction de l'ARN à partir des cellules de levure à différents points dans le temps après la transcription a été coupé. Les points de temps au cours de laquelle les cellules de levure sont récoltées sont prédéterminés par une expérience pilote, et dépendent des transcriptions et le système à l'étude. Points de temps plus rapides sont utilisés pour les transcriptions de courte durée, tandis que les points de temps plus longues sont utilisées pour les transcriptions plus vécu. Par la suite, la décomposition de l'ARNm est contrôlée soit par analyse Northern blot, la PCR quantitative ou RNAseq.

Mesure de la demi-vie d'ARNm en utilisant un température allèle sensible de l'ARN polymérase II a ses avantages. Tout d'abord, cette technique est facile et simple. Deuxièmement, une fois la souche de levure est acquis ou généré en laboratoire les ARNm mesures demi-vie peuvent être déterminées dans différentes conditions de croissance; permettant de déterminer l'influence de l'environnement sur la dégradation de l'ARNm. Troisièmement, les taux d'ARNm de désintégration peuvent être surveillés échelle du génome. L'utilisation d'autres techniques d'inhibition de la transcription a aussi des avantages et des inconvénients. Par exemple, l'utilisation d'un promoteur inductible nécessite le sous-clonage pour générer un ARNm qui est sous le contrôle du promoteur régulé. Thiolutine ne est pas facilement disponible et est coûteux lorsqu'ils sont disponibles. En outre, le mode d'action de thiolutine ne est pas complètement comprise et il a été rapporté pour affecter d'autres processus cellulaires, y compris l'inhibition de la dégradation des ARNm ^7. Alternativement, la 1,10-phénanthroline, est plus facilement disponible. En outre, toutes les techniques utilisées pour inhiber la transcription peut perturb fonction cellulaire et peut affecter différents ARNm de façons distinctes. Un enquêteur doit déterminer la méthode la plus appropriée à utiliser dans leurs conditions expérimentales pour obtenir des résultats les plus fiables. Pour déterminer quelle méthode est la plus appropriée pour leur application, un chercheur doit identifier les transcriptions et la fonction des protéines codées par les transcriptions objet d'une enquête. Les mesures les plus fiables des taux d'ARNm de décroissance sont ceux qui sont déterminés en utilisant plusieurs techniques et de montrer le même taux de décroissance. Aucune technique ne est toujours la meilleure, et la technique la plus appropriée dépend de la situation spécifique.

De nombreuses études dans S. cerevisiae ont mesuré les taux de NMD dans diverses conditions et origines génétiques. Les conditions que les taux d'ARNm de désintégration sont mesurées en dépendent l'expérience spécifique à l'étude. Mesure ARNm taux de décomposition dans des environnements cellulaires différents détermine si les conditions étanta examiné préférentiellement affecter les taux d'ARNm spécifiques de désintégration. Les taux d'ARNm de désintégration peuvent également varier en fonction de la souche de levure utilisée. Par exemple, ARNm taux de décomposition peuvent être déterminées dans les cellules de levure de type sauvage et des cellules de levure avec une voie non fonctionnel dégradation de l'ARNm de nonsense-mediated (NMD). Cette voie de dégradation de l'ARNm se trouve dans tous les organismes eucaryotes qui ont été examinés à ce jour et il déclenche la dégradation des ARNm qui se terminent prématurément traduction ^8. NMD a été initialement identifiée comme une voie qui dégrade ARNm avec des codons de terminaison prématurés ou codons non-sens, mais est maintenant reconnue comme une voie qui réglemente également l'expression de non-nonsense contenant ARNm naturelles. ARNm qui sont des cibles de la voie sont rapidement dégradées dans les cellules de levure avec une voie de NMD fonctionnel et stabilisées dans des cellules de levure avec une voie de NMD non fonctionnel. Ainsi, les demi-vies d'ARNm qui sont des cibles directes de cette voie sont plus courts en levure de type sauvage cells rapport aux cellules de levure avec une voie NMD non fonctionnel.

Protocol

1. Croissance de cellules de levure Sélectionner des souches de levure appropriées pour être utilisées pour les mesures de taux d'ARNm de la pourriture. Pour inhiber la transcription en utilisant l'allèle sensible de l'ARN polymérase II de température, utiliser des souches de levure abritant la mutation rpb1-1 1. Obtenir cette souche de levure à partir d'un laboratoire qui a déjà une, ou le générer en laboratoire en utilisant des techniques standard si un contex…

Representative Results

La capacité de ce protocole pour mesurer avec précision ARNm taux de décroissance dépend de l'inhibition de la transcription, la récolte de cellules de levure au niveau des points de temps appropriés, et l'utilisation des techniques sans RNase lors de l'extraction de l'ARN et transfert de Northern. Palpage de deux ARNm de commande connus pour être instables et stables, respectivement, fournit l'assurance que l'expérience a fonctionné. Par exemple, ceci peut être accompli par sonda…

Discussion

L'inhibition de la synthèse de l'ARNm et de surveillance chiffre d'affaires de l'ARNm en l'absence de nouvelle synthèse est une méthode qui est fréquemment utilisé pour mesurer ARNm taux de décroissance. Dans S. cerevisiae, la mesure du taux de décroissance de l'ARNm en empêchant la transcription de l'allèle sensible à l'aide de l'ARN polymérase II de la température est une des méthodes les plus fréquemment utilisés. Ce procédé inhibe spécifiquement l'AR…

Materials

Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
High Speed Centrifuge	Eppendorf	22628169
Mini Centrifuge	Fisher Scientific	05-090-100
Genescreen Plus membrane	PerkinElmer	50-905-0169
Hybridization Oven	Fisher Scientific	95-0030-01
Nanodrop spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-8000
Phosphor screen	GE Healthcare Life Sciences	28-9564-78
Typhoon phosphorimager	GE Healthcare Life Sciences	29004080
UV cross-linker	GE Healthcare Life Sciences	80-6222-31	Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80° for 1 hour
NorthernMax prehybridization/hybridization buffer	Life Technologies	AM8677
Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation			Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background