La medición de mRNA decadencia Tarifas en<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Uso<em> Rpb1-1</em> Cepas
Summary
El nivel de estado estacionario de ARNm específicos se determina por la velocidad de síntesis y la descomposición del ARNm. Las tasas de degradación de ARNm de todo el genoma o las tasas de descomposición de ARNm específicos se pueden medir mediante la determinación de ARNm de vida media. Este protocolo se centra en la medición de las tasas de descomposición de ARNm en Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
los niveles de mRNA en estado estacionario varían dependiendo de las condiciones ambientales. La regulación de los niveles de acumulación estado estacionario de un ARNm asegura que la cantidad correcta de la proteína se sintetiza por las condiciones de crecimiento específicas de la célula. Un enfoque para medir las tasas de descomposición de ARNm es la inhibición de la transcripción y, posteriormente, el seguimiento de la desaparición de la ya presente mRNA. La tasa de descomposición de ARNm puede entonces ser cuantificada, y una vida media exacta se puede determinar utilizando varias técnicas. En S. cerevisiae, los protocolos que miden mRNA vidas medias han sido desarrollados e incluyen la inhibición de la transcripción de ARNm utilizando cepas que albergan un alelo sensible a la temperatura de la ARN polimerasa II, rpb1-1. Otras técnicas para la medición de mRNA media-vidas incluyen la inhibición de la transcripción con inhibidores transcripcionales tales como thiolutin o 1,10-fenantrolina, o alternativamente, mediante la utilización de mRNAs que están bajo el control de un promotor regulabletales como el promotor inducible de galactosa y el sistema TET-off. A continuación, describimos medición de S. las tasas de descomposición de ARNm cerevisiae utilizando el alelo sensible a la temperatura de la ARN polimerasa II. Esta técnica se puede utilizar para medir las tasas de descomposición de ARNm de ARNm o de todo el genoma individuales.
Introduction
La transcripción y la descomposición de ARNm específicos son determinantes cruciales de la expresión génica. La tasa de síntesis y descomposición de ARNm específicos determina el nivel de estado estacionario de que el ARNm particular. Los niveles de estado estacionario de ARNm regulan la abundancia de ARNm y determinar la cantidad de cada mRNA está disponible para la síntesis de proteínas. Las mediciones de ARNm vidas medias se utilizan ampliamente para determinar la tasa de descomposición de ARNm. MRNAs decaimiento específico a diferentes tasas que están relacionados con las características del ARNm, la función de la proteína codificada por el ARNm y las condiciones ambientales. Dependiendo de la técnica utilizada para determinar las tasas de descomposición de ARNm, mediciones de la tasa de descomposición se pueden determinar de forma global o por transcripciones individuales. En la levadura S. cerevisiae, las técnicas que se usan más comúnmente para medir las tasas de descomposición de ARNm global incluyen la utilización de una cepa de levadura que alberga el alelo sensible a la temperatura de la ARN polimerasa II y transc químicainhibidores de riptional tales como thiolutin y 1,10-fenantrolina 1-5. Estos métodos también pueden ser utilizados para medir las tasas de descomposición de ARNm individuales 4. Otros métodos pueden utilizarse también para medir las tasas de descomposición de ARNm. Estos métodos incluyen enfoque de etiquetado de estado estacionario o la utilización de moléculas de ARNm que se expresan a partir de un promotor regulado que se expresa sólo en ciertas condiciones. Cada una de estas técnicas tiene ciertas ventajas y limitaciones. La técnica descrita aquí utiliza el alelo sensible a la temperatura de la ARN polimerasa II. Este método utiliza S. cerevisiae como el modelo, pero puede sido modificado y utilizado en otros sistemas que utilizan técnicas de inhibición de la transcripción específicos 6.
mRNA mediciones de vida media utilizando el alelo sensible a la temperatura de la ARN polimerasa II se utilizan ampliamente para ambas mediciones a escala del genoma e individuales de mRNA decadencia 4-5. Esta técnica requiere el uso de un específic cepa de levadura que alberga un alelo sensible a la temperatura de la ARN polimerasa II, rpb1-1 1. El fundamento de esta técnica es que la exposición de la cepa de levadura sensible a la temperatura a la temperatura no permisiva inhibe la síntesis de mRNA. Posteriormente, el decaimiento del ARNm preexistente se controla en diferentes puntos de tiempo después de la transcripción se ha inhibido. La desaparición del mRNA preexistente se controla mediante la extracción de ARN a partir de las células de levadura en diferentes puntos de tiempo después de la transcripción se ha apagado. Los puntos de tiempo en el que se cosechan las células de levadura están predeterminados por un experimento piloto, y dependen de las transcripciones y sistema siendo investigados. Puntos de tiempo más rápidos se utilizan para transcripciones de corta duración, mientras que los puntos de tiempo más largos se utilizan para transcripciones de vida más larga. Después, el decaimiento del ARNm se controla por cualquiera de análisis de transferencia Northern, PCR cuantitativa o RNAseq.
La medición de mRNA vidas medias usando una temperatura alelo sensible de la ARN polimerasa II tiene sus ventajas. En primer lugar, esta técnica es fácil y sencillo. En segundo lugar, una vez que la cepa de levadura se adquiere o se genera en el laboratorio de las mediciones de la vida media de ARNm se pueden determinar en diferentes condiciones de crecimiento; para determinación de la influencia del medio ambiente en mRNA decadencia. En tercer lugar, las tasas de descomposición de ARNm pueden ser monitoreados en todo el genoma. El uso de otras técnicas de inhibición de la transcripción también tiene ventajas y limitaciones. Por ejemplo, el uso de un promotor inducible requiere subclonación para generar un ARNm que está bajo el control del promotor regulado. Thiolutin no está fácilmente disponible y es caro cuando esté disponible. Además, el modo de thiolutin de acción no se entiende completamente y se ha informado a afectar a otros procesos celulares, incluyendo la inhibición de descomposición de ARNm 7. Alternativamente, 1,10-fenantrolina, es más fácilmente disponible. Además, todas las técnicas utilizadas para inhibir la transcripción puede perturb función celular y puede afectar a diferentes ARNm de maneras distintas. Un investigador debe determinar el método más apropiado para utilizar en sus condiciones experimentales para obtener los resultados más fiables. Para determinar qué método es el más adecuado para su aplicación, un investigador necesita identificar las transcripciones y función de las proteínas codificadas por las transcripciones que se investigan. Las mediciones de la tasa por mRNA decadencia más fiables son los que se determinó a través de múltiples técnicas y muestran la misma velocidad de desintegración. Ninguna técnica es siempre la mejor, y la técnica más apropiada depende de la situación específica.
Numerosos estudios en S. cerevisiae han medido las tasas de descomposición de ARNm en diferentes condiciones y las bases genéticas. Las condiciones que las tasas de descomposición de ARNm se miden en dependen del experimento específico siendo investigado. Medición de las tasas de descomposición de ARNm en diferentes entornos celulares determina si las condiciones de serexaminados afectar preferentemente las tasas de descomposición de ARNm específicos. Las tasas de descomposición de ARNm también puede variar dependiendo de la cepa de levadura que se utiliza. Por ejemplo, las tasas de descomposición de ARNm se pueden determinar en células de levadura de tipo salvaje y las células de levadura con una vía funcional degradación del ARNm tontería mediada (NMD). Esta vía de degradación de ARNm se encuentra en todos los organismos eucariotas que se han examinado hasta ahora y que provoca la degradación de los ARNm que terminan prematuramente traducción 8. NMD se identificó inicialmente como una vía que degrada mRNAs con codones de terminación prematuros o codones sin sentido, pero ahora se reconoce como una vía que también regula la expresión de la no-absurdo que contiene mRNAs naturales. mRNAs que son objetivos de la vía se degradan rápidamente en células de levadura con una vía NMD funcional y se estabilizaron en células de levadura con una vía de NMD no funcional. Por lo tanto, la vida media de los ARNm que son blancos directos de esta vía son más cortos en levadura de tipo salvaje cells comparación con las células de levadura con una vía de NMD no funcional.
Protocol
Representative Results
Discussion
La inhibición de la síntesis de mRNA y el seguimiento de rotación de ARNm en la ausencia de nueva síntesis es un método que se utiliza frecuentemente para medir las tasas de descomposición de ARNm. En S. cerevisiae, la medición de las tasas de descomposición de ARNm mediante la inhibición de la transcripción mediante el alelo sensible a la temperatura de la ARN polimerasa II es uno de los métodos más frecuentemente utilizados. Este método inhibe específicamente la ARN polimerasa II. Los pasos más…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in the author’s laboratory is supported by the Texas Higher Education Coordinating Board’s Norman Hackerman Advanced Research Program and start-up funds from Baylor University.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| High Speed Centrifuge | Eppendorf | 22628169 | |
| Mini Centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Genescreen Plus membrane | PerkinElmer | 50-905-0169 | |
| Hybridization Oven | Fisher Scientific | 95-0030-01 | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-8000 | |
| Phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-78 | |
| Typhoon phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | 29004080 | |
| UV cross-linker | GE Healthcare Life Sciences | 80-6222-31 | Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80° for 1 hour |
| NorthernMax prehybridization/hybridization buffer | Life Technologies | AM8677 | |
| Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation | Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background | ||
References
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