mRNA의 붕괴 요금의 측정에<em> 사카로 미세스 세 레비 시아</em사용><em> rpb1-1</em> 균주
Summary
특정의 mRNA의 정상 수준은 mRNA의 합성과 부패의 속도에 의해 결정된다. 전체 게놈 mRNA의 분해율 또는 특정의 mRNA 붕괴 속도는 mRNA의 반감기를 측정함으로써 측정 할 수있다. 이 프로토콜은 사카로 미세스 세 레비 시아에서 mRNA의 붕괴 속도의 측정에 초점을 맞추고있다.
Abstract
mRNA의 정상 상태 수준은 환경 조건에 따라 달라집니다. mRNA를 정상 상태 축적 레벨의 규정은 단백질의 정확한 양이 특정 셀의 성장 조건에 대해 합성되는 것을 보장한다. mRNA의 붕괴 속도를 측정하기위한 한 가지 방법은 전사를 억제이어서 이미 존재하는 mRNA를 소실을 모니터링. mRNA의 붕괴 속도는 정량화 될 수 있으며, 정확한 반감기는 여러 기술을 이용하여 결정될 수있다. S.에서 cerevisiae의, 반감기가 개발 된 mRNA의 측정 및 RNA 중합 효소 II, rpb1-1의 온도에 민감한 대립 유전자 항구 균주를 사용하여 mRNA의 전사를 억제 포함 프로토콜을 지원합니다. 조절 성 프로모터의 제어하에 mRNA를을 이용하여 반감기는 대안 thiolutin 또는 1,10- 페난 트롤 린, 또는 전사와 전사 억제제를 포함 mRNA의 억제를 측정하기위한 다른 기술,이러한 갈락토스 유도 성 프로모터와 TET 오프 시스템으로. 여기서 우리는 S.의 측정을 설명 RNA 중합 효소 II의 온도에 민감한 대립 유전자를 사용하여 cerevisiae의 mRNA의 붕괴 속도. 이 기술은 개인의 mRNA 또는 게놈의 전체 mRNA의 붕괴 속도를 측정하는데 사용될 수있다.
Introduction
전사 및 특정 mRNA를 붕괴는 유전자 발현의 중요한 결정 요인이다. 합성 및 특정의 mRNA의 붕괴 속도는 특정 mRNA를 정상 상태 수준을 결정합니다. 의 mRNA의 정상 상태 수준의 mRNA의 풍요 로움을 지배하고 단백질 합성에 사용할 수 있습니다 얼마나 많은 각각의 mRNA를 결정합니다. mRNA의 반감기의 측정의 mRNA 붕괴 속도를 결정하기 위해 광범위하게 사용된다. mRNA의, mRNA와 환경 조건에 의해 암호화 된 단백질의 기능의 기능에 관련된 다른 속도 특정 mRNA를 붕괴. mRNA의 붕괴 속도를 판단하기 위해 이용 된 기술에 따라서, 감소율 측정은 전역 적 또는 개별 사체에 대해 결정될 수있다. 효모 S.에서 cerevisiae에 가장 일반적으로 전체 mRNA의 붕괴 속도를 측정하는데 사용되는 기술은 RNA 중합 효소 II 화학 transc의 온도 민감성 대립 유전자를 보유하는 효모 균주를 이용하는 것을 포함이러한 thiolutin 1,10- 페난 트롤 린 1-5 riptional 억제제. 이러한 방법은 또한 개개의 mRNA 붕괴 속도 4를 측정하는데 이용 될 수있다. 다른 방법은 mRNA의 붕괴 속도를 측정하는데 이용 될 수있다. 이러한 방법은 정상 상태 표시 또는 유일한 선택 조건에서 발현되는 규제 프로모터로부터 발현되는 mRNA의 분자의 활용에 대한 접근 방법을 포함한다. 이러한 기술의 각 특정 장점과 제한 사항이 있습니다. 여기에 기재된 기술은 RNA 중합 효소 II의 온도 민감성 대립 유전자를 이용한다. 이 방법을 사용하여 S. cerevisiae의 모델로서, 특정 전사 억제 기술 (6)을 사용하는 다른 시스템들에서 이용되어 변형과 수 있지만.
RNA 중합 효소 II의 온도에 민감한 대립 유전자를 사용하여 mRNA의 반감기 측정은 광범위하게 mRNA의 붕괴 4-5의 두 게놈 전체 및 개별 측정에 사용됩니다. 이 기술과 특이의 사용을 필요RNA 중합 효소 II, rpb1-1 1의 온도에 민감한 대립 유전자를 품고 IC 효모 균주. 이 기술에 대한 이론적 근거는 nonpermissive 온도로 온도에 민감한 효모의 노출이 mRNA의 합성을 억제한다는 것입니다. 전사가 억제 된 후에 계속해서, 기존의 mRNA 붕괴가 상이한 시점에서 모니터링된다. 기존의 mRNA 전사 소멸이 해제 된 후에 서로 다른 시간 지점에서 효모 세포로부터 RNA를 추출하여 모니터링된다. 효모 세포를 수확하는 시점은 파일럿 실험에 의해 미리 결정된 및 성적 및 시스템이 연구되고에 달려있다. 긴 시간 점 이상 거주 증명서에 사용하는 동안 더 빨리 시점은, 단명 한 성적 증명서에 사용됩니다. 그 후, mRNA를 붕괴 중 하나 북부 얼룩 분석, 정량적 PCR 또는 RNAseq 모니터링합니다.
테를 사용하여 mRNA의 반감기의 측정RNA 중합 효소 II의 mperature 민감한 대립 유전자는 장점이있다. 첫째,이 기술은 곧장 앞으로 쉽고입니다. 둘째, 효모 균주는 mRNA의 반감기의 측정은 다른 성장 조건을 결정할 수있다 실험실에서 획득되거나 생성되면; mRNA의 붕괴에 대한 환경 영향의 결정을 가능하게한다. 셋째, mRNA의 붕괴 속도는 전체 게놈 모니터링 할 수있다. 다른 전사 억제 기술의 사용은 또한 장점과 제한 사항이 있습니다. 예를 들어, 유도 성 프로모터의 사용은 조절 된 프로모터의 제어하에 mRNA를 생성하기 위해 서브 클로닝이 필요하다. Thiolutin는 준비되지 않은 때 비싼 사용할 수 있습니다. 또한, 동작 모드의 thiolutin의 완전히 이해되지 않고,이 mRNA를 감쇠 7 억제를 포함하는 다른 세포 과정에 영향을 미치는 것으로보고되었다. 또한, 1,10- 페난 트롤 린은, 더 쉽게 사용할 수 있습니다. 또한, 모든 기술은 PERT 수 전사를 억제하기 위해 사용세포 기능을 URB 별개의 방식으로 서로 다른 mRNA에 영향을 미칠 수 있습니다. 조사원은 가장 신뢰할 수있는 결과를 달성하기 위해 자신의 실험 조건에서 사용하기에 가장 적절한 방법을 결정할 필요가있다. 자신의 애플리케이션에 가장 적합한 방법을 결정하기 위해, 연구원 조사되는 성적 증명서에 의해 코딩되는 단백질의 성적 증명서 및 함수를 식별 할 필요가있다. 가장 신뢰할 수있는 mRNA의 감쇠율 측정은 여러 기술들을 사용하여 동일한 감쇠율을 표시해서 결정들이다. 어떤 하나의 기술은 항상 가장없고, 가장 적당한 방법은 특정 상황에 따라 달라진다.
S.에서 많은 연구 cerevisiae의 다양한 조건과 유전 적 배경에서 mRNA의 붕괴 속도를 측정했다. mRNA의 붕괴 속도가 측정되는 조건은 특정 실험 조사를 받고에 따라 달라집니다. 조건이 존재하는지 여부 다른 셀룰러 환경에서의 mRNA 붕괴 속도를 측정하는 것은 결정우선적으로 특정의 mRNA 붕괴 속도에 영향을 조사 하였다. 의 mRNA의 붕괴 속도는 사용되는 효모에 따라 달라질 수 있습니다. 예를 들면, mRNA의 붕괴 속도는 비 기능성 넌센스 매개 mRNA의 분해 (NMD) 통로와 야생형 효모 세포 및 효모 세포에서 결정될 수있다. 이 mRNA의 분해 경로는 지금까지 조사 된 모든 진핵 생물에서 발견되며, 이는 번역 8 조기 종료의 mRNA의 분해를 트리거한다. NMD는 초기에 조기 종료 코돈 또는 넌센스 코돈과의 mRNA를 분해 경로로 확인되었다,하지만 지금은 천연의 mRNA를 포함하는 비 넌센스의 발현을 조절하는 통로로 인식되고 있습니다. 경로의 대상이되는 mRNA를 빠르게 기능 NMD 경로와 효모 세포에서 분해 및 비 기능 NMD 경로와 효모 세포에서 안정화된다. 따라서,이 경로의 직접적인 대상인의 mRNA의 반감기는 야생형 효모에서 CEL 짧다비 기능 NMD 통로와 효모 세포에 비해 LS.
Protocol
Representative Results
Discussion
mRNA의 합성과 새로운 합성의 부재 하에서 mRNA의 회전율을 모니터링 억제 자주 mRNA의 붕괴 속도를 측정하는데 사용되는 방법이다. S.에서 cerevisiae를는 RNA 중합 효소 II의 온도 민감성 대립 유전자를 사용하여 전사를 억제함으로써 mRNA의 붕괴 속도의 측정은 가장 자주 사용되는 방법 중 하나이다. 이 방법은 구체적으로는 RNA 중합 효소 II를 억제한다. 이 기술을 사용하여 mRNA의 붕괴 속도의 결정…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in the author’s laboratory is supported by the Texas Higher Education Coordinating Board’s Norman Hackerman Advanced Research Program and start-up funds from Baylor University.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| High Speed Centrifuge | Eppendorf | 22628169 | |
| Mini Centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Genescreen Plus membrane | PerkinElmer | 50-905-0169 | |
| Hybridization Oven | Fisher Scientific | 95-0030-01 | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-8000 | |
| Phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-78 | |
| Typhoon phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | 29004080 | |
| UV cross-linker | GE Healthcare Life Sciences | 80-6222-31 | Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80° for 1 hour |
| NorthernMax prehybridization/hybridization buffer | Life Technologies | AM8677 | |
| Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation | Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background | ||
References
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