Summary
特定的mRNA的稳态水平由合成的mRNA和衰减率决定。的全基因组的mRNA的降解率或特异mRNAs的衰变率可通过测定mRNA的半衰期进行测定。该协议的重点是mRNA降解率在酿酒酵母中的测量。
Abstract
mRNA的稳态水平取决于环境条件。的mRNA的稳态积累水平的调节可以确保蛋白质的正确数量被合成为细胞的具体生长条件。用于测量的mRNA衰变速率的一种方法是抑制转录并随后监测已经存在的mRNA的消失。 mRNA降解的速率可以被量化,并准确半衰期可以利用几种技术来确定。在S.酵母 ,衡量半衰期已经开发的mRNA和包括使用窝藏RNA聚合酶II,rpb1-1温度敏感的等位基因株抑制mRNA的转录协议。其它技术,用于测量mRNA的半衰期包括抑制转录与转录抑制剂如thiolutin或1,10-菲咯啉,或可替代地,通过利用的mRNA即是一个可调节的启动子的控制下如半乳糖诱导型启动子和TET关闭系统。在这里,我们描述的测量S.使用RNA聚合酶II的温度敏感等位基因酵母 mRNA降解速率。这种技术可用于测量单个的mRNA或基因组范围的mRNA降解速率。
Introduction
转录和特定的mRNA衰变是基因表达的关键决定因素。合成与特定mRNA的衰减率确定该特定mRNA的稳态水平。 mRNA的稳态水平支配mRNA的丰度,并确定如何每个mRNA的多少是可用于蛋白质的合成。 mRNA的半衰期的测量结果被广泛用于确定mRNA的衰减率。特定的mRNA衰变在所涉及到的mRNA,由mRNA和环境条件所编码的蛋白质的功能的特定功能不同的费率。根据用来确定mRNA降解率的技术,衰减率测量结果可以决定全局或个人成绩单。在酵母S.酵母 ,其是最常见的用于测量全球的mRNA衰变速率的技术包括使用酵母菌株携带RNA聚合酶II和化学创见的温度敏感等位基因riptional抑制剂如thiolutin和1,10-菲咯啉1-5。这些方法也可用于测量单个mRNA降解率4。其它方法也可用于测量mRNA衰变速率。这些方法包括方法稳态标签或利用,从这个表示只有在选择条件调节的启动子表达的mRNA分子。每种技术具有一定的优点和局限性。此处所描述的技术利用RNA聚合酶II的温度敏感等位基因。此方法使用S.酵母作为模型,但可使用特异性转录抑制技术6被修改,并用在其他系统。
使用RNA聚合酶II的温度敏感等位基因的mRNA的半衰期的测量被广泛地用于mRNA降解4-5的两个全基因组和单独的测量。此技术需要使用注明:的IC酵母菌株窝藏RNA聚合酶II,rpb1-1 1的温度敏感等位基因。这种技术的原理是,将温度敏感酵母菌株的非允许温度的曝光抑制mRNA合成。随后,将先前存在的mRNA衰变在不同时间点监测转录被禁止之后。所述预先存在的mRNA的消失是通过从酵母细胞中提取的RNA在不同时间点之后的转录已关闭监测。在该酵母细胞收获的时间点是由一个先导实验预先确定的,并且依赖于转录本和系统正在研究中。更快的时间点被用于短暂的成绩单,而更长的时间点被用于再住成绩单。此后,mRNA的衰变由或Northern印迹分析,定量PCR或RNAseq监测。
使用TE的mRNA半衰期的测量RNA聚合酶II的mperature敏感的等位基因有它的优势。首先,该技术是简单和直接的。第二,一旦酵母菌株而获得或产生在实验室中的mRNA半衰期测量可以在不同的生长条件来确定;从而能够确定对mRNA降解环境的影响。第三,mRNA降解速率可以被监测的全基因组。使用其他转录抑制技术,也有优点和局限性。例如,使用诱导型启动子的要求亚克隆以产生的mRNA,它是调节性启动子的控制下。 Thiolutin不是现成的,价格昂贵时可用。此外,行动thiolutin的模式没有被完全理解,并已报道影响其他细胞过程,包括抑制mRNA降解7。可替代地,1,10-菲咯啉,更容易获得。此外,所有的技术的用于抑制转录的可PERTURB细胞功能,并可以影响不同的方式不同的mRNA。研究者需要确定的最适当的方法来使用在他们的实验条件下获得最可靠的结果。要确定哪种方法适合其应用的最合适的,研究人员需要确定的成绩单编码的蛋白质被调查的成绩单和功能。最可靠的mRNA衰变率测量是那些使用决定的多个技术和显示相同的衰减率。没有单一的技术总是最好的,最合适的方法取决于具体的情况。
在S.大量的研究酵母已经测量在不同的条件和遗传背景的mRNA降解率。该mRNA的衰变率被测量的条件取决于具体的实验正在研究中。测量的mRNA降解率在不同的细胞环境决定的条件是否被已审查优先影响特异mRNAs的衰变速率。 mRNA的衰变率还可以取决于所述酵母菌株被使用。例如,mRNA的衰变率,可在野生型酵母细胞和酵母细胞与非功能无义介导的mRNA降解(NMD)途径来确定。这种mRNA的降解途径是发现在已检查到目前为止所有真核生物和它触发的mRNA即过早终止翻译8的降解。 NMD被初步确定为途径降解的mRNA与提前终止密码子或无义密码子,但现在已被视为一个途径也调节含有天然的mRNA不废话的表达。的mRNA即是该途径的目标迅速降解在酵母细胞中具有功能的NMD途径和稳定的在酵母细胞中与非功能性的NMD途径。因此,半衰期的mRNA即是该途径的直接目标是短于野生型酵母CELLS相比,酵母细胞与非功能NMD途径。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.成长酵母细胞
- 选择要被用于与mRNA衰变率测量相应的酵母菌株。使用RNA聚合酶II的温度敏感等位基因抑制转录,使用酵母菌株窝藏rpb1-1突变1。从已经具有一个实验室获得该酵母菌株,或使用如果特定遗传背景,需要9的标准技术在实验室中生成它。
- 使用无菌技术,用标准方法10制备的酵母介质。如果没有选择要求,准备丰富的媒体,例如YPD。可替代地,制备的选择性培养基,如果酵母细胞转化用质粒和选择是必需的。高压灭菌介质。
- 生长的酵母细胞在28℃,这是允许的温度下此酵母菌株。为此在两个步骤:
- 对于第一个O / N,成长在5毫升生长介质中饱和的酵母细胞。
- 设置了第二O / N在第二一天结束。对于第二个O / N,接种不同量的酵母细胞从第一O / N为100至150ml生长培养基(范围从100微升至1毫升,2毫升以上的,这取决于当酵母细胞需收获翌日)。做到这一步,以确保培养物中的一个是在正确的OD 600翌日。
2.嘉实酵母细胞
- 准备收获的酵母细胞。对于此步骤的时序是至关重要的;标记所需的所有管和收集所有必需的设备和材料在一个地方。预热的水浴至39℃,预热的生长培养基的2个15 ml的试验管中,在28℃,并在60℃。
注:15毫升生长培养基体积可以根据时间点的细胞被收获的数目而变化。 - 收获酵母细胞,当他们到达的OD 600为0.4至0.7。 TRANSF呃细胞以4 - 6无菌50毫升螺旋盖瓶。在高速离心机离心在7500×g离心5分钟,在室温。
- 弃上清,重悬在15毫升培养基被平衡在28°C的颗粒。普尔的酵母细胞在一个无菌的250ml烧瓶中并平衡它们〜5分钟,在28℃的生长温度。
- 后的酵母细胞已经平衡在生长温度后,立即添加15毫升平衡在60℃的生长培养基中升温至39℃(在非允许温度),并立即将该烧瓶在39℃的水浴。确保培养基保持在整个剩余的细胞收获步骤39℃的水浴,以确保转录被关闭。
- 将烧瓶置于39℃水浴中后收获细胞在不同的时间。对于第一个时间点,将所述烧瓶在39&#后,立即收集细胞176℃。收获3毫升一份和分发3毫升分为二,1.5 ml离心管。颗粒细胞进行10秒的迷你离心机或picofuge快速减速和倾出上清液。
- 立即冻结沉淀在干冰/乙醇浴中或在液氮中。指定第一时间点收获细胞,在作为零时间点。
- 实验确定的时间点收集细胞,在之后通过预实验,取决于感兴趣的mRNA。正常情况下,收获酵母细胞在以下时间点:0,3,6,9,12,18,25和35分钟( 图2B)。如果mRNA的半衰期可以不使用上述的时间点来确定,调整这些时间点。例如,对于mRNA的与预期的短半衰期,可使用更短的时间点( 即,0,1,2,3,4,6,9,12和18分钟),并为与mRNA的预期半衰期很长,延长的时间点。
- 细胞后都公顷rvested,将它们存储在一个-80℃的冷冻机,直到RNA提取被执行。
从酵母细胞中提取3 RNA
- 对于该协议的RNA提取部分,使用无RNase技术,以防止RNA的降解RNA酶。制备无RNase溶液,玻璃器皿和塑料制品中的RNA的提取中使用。
- 根据标准方法从酵母细胞中提取的RNA。通常情况下,使用热酚法12。或者,使用可用于从酵母细胞中提取的RNA的试剂盒。
- 确定RNA的数量和纯度,通常通过测量吸光度A处260和使用NanoDrop甲280 2的RNA微升。确定从基于浓度在A 260的RNA的浓度,淡化核糖核酸至1微克/微升使用DEPC处理的水。
注:在A 260的比值/ A 280提供了对T的信息他纯度的RNA。 RNA样品是纯粹如果A 260 / A 280比值为2.0±0.1。
4. Northern blot分析
注意:使用RNA印迹来量化mRNA水平,将获得的转录物的大小的信息。此外,使用RNA印迹来检测产生相同的mRNA的多个同种型的mRNA。
- 制备1.0%琼脂糖 - 甲醛凝胶。根据标准方法12通过电泳运行样品的RNA上的琼脂糖甲醛凝胶等量。运行的RNA梯子沿着RNA样品,并用它来确定的Northern印迹中检测到的RNA的大小。前传送上分离的琼脂糖甲醛凝胶到膜的核糖核酸,切断与从凝胶中的RNA的梯子的车道和可视化用溴化乙锭。
注意:可替换地,整个凝胶可以用溴化乙锭将RNA转移前染色。 - 一压脚提升的RNA样品已经迁移到凝胶上的一个适当的距离,用无RNA酶的技术将RNA转移到膜上。使用多种协议提供一个RNA转移到膜12-13。到的RNA转移到膜,切膜以大致相同的尺寸的凝胶。根据标准方法12转移核糖核酸。
- 紫外线使用UV交联剂按照制造商的说明将RNA交叉链接到该膜。可替代地,烘烤该膜在烘箱中设定为80℃1小时。存储所述膜在-20℃下在一个塑料袋无限期,直到它被杂交到特异性探针。
注:干膜也可以被存储在RT滤纸之间。
5.杂交探针互补,以利益为膜的RNA
注:以检测mRNA的在膜的一个方法是杂交32 p标记的DNA探针。注意:Researchers用32 P工作需要使用保护程序,以防止污染。按照上使用的放射性物质的机构准则。
- 通过标记25制备的DNA探针- DNA的50纳克到根据标准方法12杂交到膜上。产生由PCR或质粒消化的DNA片段。通过计数1微升放射性标记的DNA探针的未掺入的核苷酸被除去12后确定DNA探针的特定活性。
- 在42℃预热预杂交/杂交缓冲液。使用〜10毫升每膜12为100 平方厘米的预杂交/杂交缓冲液中。
- 杂交1 - 5×10 6的cpm每毫升杂交缓冲放射性标记的DNA探针与膜的O / N的杂交烘箱检测感兴趣12的mRNA的表达。确保该杂交过程中的杂交炉旋转的方向上导致整个膜暴露于杂交溶液,以确保适当的杂交。
- 在RT下用50ml 2×SSPE和一次在65℃下用50ml 2×SSPE / 2%的SDS的15分钟12洗膜两次,每次15分钟。敷膜在保鲜膜,以确保它不会干枯或污染荧光屏。
- 用一个盖革计数器,估计在膜上的放射性强度。
注:此估计可以确保该膜暴露于荧光屏的时间的适当的量。使用较长的曝光时间为膜具有低量的放射性。 - 对于北部的印迹,使用装载控制,以确认RNA等量上的每个点都加载。要做到这一点,剥离膜,并与不受被检查的过程中的RNA重新探测它。通过将其放置在含有200毫升沸腾的汽提液(0.1%SDS / 0.01 XS的一个玻璃托盘剥离膜SC)的2分钟。倒出剥离方案,并重复上述步骤五次12。
注意:用作上样对照的RNA的一个实例是SCR1 SCR1是RNA聚合酶III转录物是稳定的和丰富的期间RNA聚合酶II的抑制短期SCR1的RNA丰度不应显著变化。
6.量化绑定到膜的RNA
注意:为了量化放射性量上膜,该膜暴露于一荧光屏。合适的曝光时间后,扫描用磷屏荧光屏。
- 扫描使用由磷屏的制造商提供的说明荧光屏。
- 量化mRNA的每个时间点。量化使用ImageQuant软件或相关软件的mRNA水平。归一化的mRNA在各时间点的负荷的控制。如果SCR1被用作装载控制,正常化半衰期northerns到SCR1。
- 的mRNA的半衰期是通过分割的mRNA在由mRNA的存在量每个时间点剩余在时间点0的量(初始时间点)来计算。格拉夫百分比的mRNA其余与时间的关系上的半对数图 ( 图2C)。计算的mRNA的半衰期由下面的等式:
吨1/2 = -0.693 / K(负0.693) - k是最佳拟合线的斜率和叔1/2是mRNA的半衰期。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
该协议的精确测量的mRNA降解率的能力依赖于抑制转录,酵母细胞在适当的时间点收获,并利用RNA酶技术,同时提取RNA和北部的印迹。探测已知是不稳定的,稳定的,两个分别控制的mRNA,提供了实验工作的信心。例如,这可以通过用探头,其检测两前体mRNA和CYH2探测来完成的mRNA。 图2B示出了CYH2前mRNA中的野生型和NMD突变酵母菌株在不同时间点的转录后抑制的消失。所述CYH2前mRNA被降解在酵母细胞更快与官能NMD途径(UPF1)相对于酵母细胞与非功能性的NMD途径(UPF1)。
40fig1highres.jpg“/>
图1.方法流程图 。 mRNA的衰变率测流程图
图2的mRNA CYH2的半衰期-pre-mRNA和mRNA的表达。(A)中的 CYH2前mRNA和CYH2基因。CYH2前mRNA的示意图是低效剪接并输送到那里通过在NMD降解细胞质途径。所述CYH2基因不被NMD的途径,因为它缺乏含有提前终止密码子(PTC)的内含子退化。(B)中的RNA的半衰期northern印迹从野生型(UPF1)和NMD突变菌株(UPF1)萃取。 TRA后的时间点nscription抑制列以上北部印迹。印迹进行探测与放射性标记CYH2的DNA。(C)的 %CYH2 mRNA前剩余时间相对于在野生型(UPF1)和NMD突变菌株(UPF1)的曲线图。该曲线图表明,CYH2预先的mRNA被降解以更快的速度在野生型(UPF1)高于NMD突变酵母菌株(UPF1)。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
mRNA的合成和监测mRNA更新在没有新合成的抑制是经常用于测量mRNA衰变率的方法。在S.酵母 mRNA的衰变率通过使用RNA聚合酶II的温度敏感等位基因抑制转录的测量是最常用的方法之一。该方法特异性抑制RNA聚合酶II。测定使用这种技术的mRNA衰变率的最重要的步骤是:1)在此之前收获酵母细胞中,确保转录已切断通过保持培养在39℃; 2)在RNA提取和RNA凝胶电泳步骤的协议确保无RNA酶的技术被使用; 3)使用控制RNA的标准化,以确保RNA被加载等量的实验性治疗是否按预期工作; 4)重复的mRNA衰变率测量至少三次,以确保再现性的半衰期测量D转换精度。
rpb1-1酵母菌株通常转移到37℃,以抑制转录。然而,我们已发现,在37℃下抑制转录发生〜3分钟的温度后移。在39℃的转录抑制是直接4,11。但是,使用这种技术来确定的mRNA降解率有一定的局限性。的主要限制是,一个特殊的酵母菌株是必需的。如前所述,此酵母菌株可以从其他实验室获得或在实验室中产生的,如果需要特定的酵母的遗传背景。一旦获得酵母菌株,该技术是简单和直接的。第二个限制是,该方法需要暴露酵母细胞热休克抑制转录。热应激能够影响细胞过程,包括特定mRNA的衰减率。例如,这些mRNA的衰变率塔对于参与应激反应的蛋白质吨编码可能会受到影响。最后,一个酵母菌株在RNA聚合酶II的突变的利用可导致生产不同行为的从正常转录替代转录。
正如在简介中所讨论的,其他技术都用来测量mRNA降解率S.酵母 。这包括使用化学物质如thiolutin和1-10菲咯啉抑制转录。这些技术是有利的,因为它们可以通过使用任何酵母菌株和mRNA衰减率也可确定全基因组或单个的内源性转录物。此外,mRNA的衰变率测量可在各种生理条件下进行。这些药物的效用由以下事实,它们也可以影响细胞过程和影响mRNA的衰变率差异的限制。此外,thiolutin不是现成的,可当是昂贵的。
掌握该技术后1将能够确定个别的mRNA或基因组范围的mRNA降解速率。此外,mRNA降解率可以在不同的生理条件下进行测量,研究不同条件是否会影响mRNA降解率差异。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
High Speed Centrifuge | Eppendorf | 22628169 | |
Mini Centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
Genescreen Plus membrane | PerkinElmer | 50-905-0169 | |
Hybridization Oven | Fisher Scientific | 95-0030-01 | |
Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-8000 | |
Phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-78 | |
Typhoon phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | 29004080 | |
UV cross-linker | GE Healthcare Life Sciences | 80-6222-31 | Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80° for 1 hour |
NorthernMax prehybridization/hybridization buffer | Life Technologies | AM8677 | |
Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation | Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background |
References
- Nonet, M., Scafe, C., Sexton, J., Young, R. Eukaryotic RNA polymerase conditional mutant that rapidly ceases mRNA synthesis. Mol. Cell. Biol. 7, 1602-1616 (1987).
- Santiago, T. C., Purvis, I. J., Bethany, A. J., Brown, A. J. The relationship between mRNA stability and length in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 14 (21), 8347-8360 (1986).
- Jimenez, A., Tipper, D. J., Davies, J. Mode of action of thiolutin, an inhibitor of macromolecular synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Antimicrob Agents Chemother. 3 (6), 729-738 Forthcoming.
- Herrick, D., Parker, R., Jacobson, A. Identification and Comparison of stable and unstable mRNAs in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 10 (5), 2269-2284 Forthcoming.
- Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. Genome-wide Analysis of mRNA Stability Using Transcription Inhibitors and Microarrays Reveals Postranscriptional Control of Ribosome Biogenesis Factors. Mol Cell Biol. 24 (12), 5534-5547 (2004).
- Tani, H., Akimitsu, N. Genome-wide technology for determining RNA stability in mammalian cells. RNA Biology. 9 (10), 1233-1238 (2012).
- Pelechano, V., Perez-Ortin, J. E. The transcriptional inhibitor thiolutin blocks mRNA degradation in yeast. Yeast. 25, 85-92 (2008).
- Kervestin, S., Jacobson, A. NMD: a multifaceted response to premature translational termination. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 700-712 (2012).
- Kolodziej, P. A., Woychik, N., Liao, S. M., Young, R. A. RNA Polymerase II subunit composition, stoichiometry and phosphorylation. Mol Cell Biol. 10 (5), 1270-1275 (1990).
- Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. Current Protocols in Molecular Biology. , John Wiley and Sons, Inc.. (1998).
- Kebaara, B. W., Nazarenus, T., Taylor, R., Atkin, A. L. Genetic background affects relative nonsense mRNA accumulation in wild-type and upf mutant yeast strains Current Genetics). 43, 171-177 (2003).
- Kebaara, B. W., Baker, K. E., Patefield, K. D., Atkin, A. L. Analysis of Nonsense-Mediated mRNA Decay in Saccharomyces cerevisiae. Current Protocols in Cell Biology. 27 (27.3), 27.3.1-27.3.39 (2012).
- Hu, W., Coller, J. Methods for measuring mRNA Decay Rate in Saccharomycescerevisiae. Methods in Enzymology. 530, 137-155 (2013).