MRNA के क्षय दरों की माप में<em> Saccharomyces cerevisiae</em> का प्रयोग<em> Rpb1-1</em> खींच
Summary
विशिष्ट mRNAs का स्थिर राज्य स्तर mRNA की संश्लेषण और क्षय की दर से निर्धारित होता है। जीनोम चौड़ा mRNA के क्षरण दर या विशिष्ट mRNAs का क्षय दरों mRNA के आधा जीवन के निर्धारण से मापा जा सकता है। इस प्रोटोकॉल Saccharomyces cerevisiae में mRNA क्षय दरों की माप पर केंद्रित है।
Abstract
mRNA के स्थिर राज्य स्तर पर्यावरण की स्थिति पर निर्भर करता है। एक mRNA की स्थिर राज्य संचय के स्तर का विनियमन प्रोटीन की सही मात्रा में सेल के विशेष विकास की स्थिति के लिए संश्लेषित है कि यह सुनिश्चित करता है। MRNA के क्षय दर को मापने के लिए एक दृष्टिकोण प्रतिलेखन बाधा और बाद में पहले से ही मौजूद mRNA की लापता होने निगरानी कर रहा है। mRNA के क्षय की दर फिर मात्रा निर्धारित किया जा सकता है, और एक सटीक आधा जीवन कई तकनीकों का उपयोग निर्धारित किया जा सकता है। एस में cerevisiae, आधा जीवन विकसित किया गया है mRNA के उपाय और शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय, rpb1-1 के तापमान संवेदनशील एलील बंदरगाह कि उपभेदों का उपयोग कर mRNA की प्रतिलेखन बाधा शामिल है कि प्रोटोकॉल। एक regulatable प्रमोटर के नियंत्रण के तहत कर रहे हैं कि mRNAs का उपयोग करके आधा जीवन में इस तरह के वैकल्पिक रूप से thiolutin या 1,10-phenanthroline, या के रूप में ट्रांसक्रिप्शनल inhibitors के साथ प्रतिलेखन बाधा शामिल हैं mRNA के मापने के लिए अन्य तकनीकों,ऐसे गैलेक्टोस inducible प्रमोटर और TET बंद प्रणाली के रूप में। यहाँ, हम एस के माप का वर्णन शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय के तापमान संवेदनशील एलील का उपयोग कर cerevisiae mRNA के क्षय दरों। इस तकनीक को व्यक्तिगत mRNAs या जीनोम चौड़ा की mRNA के क्षय दर को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
प्रतिलेखन और विशिष्ट mRNA की क्षय जीन अभिव्यक्ति की महत्वपूर्ण निर्धारक हैं। संश्लेषण और विशिष्ट mRNAs का क्षय की दर है कि विशेष रूप mRNA की स्थिर राज्य स्तर निर्धारित करता है। mRNAs का स्थिर राज्य स्तर mRNAs का बहुतायत सरकार और प्रोटीन संश्लेषण के लिए उपलब्ध है कितना प्रत्येक mRNA की निर्धारित करते हैं। MRNA के आधा जीवन की माप mRNAs का क्षय की दर निर्धारित करने के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल कर रहे हैं। MRNA, mRNA और पर्यावरण की स्थिति द्वारा इनकोडिंग प्रोटीन के समारोह की सुविधाओं से संबंधित हैं जो अलग-अलग दरों पर विशिष्ट mRNAs क्षय। MRNA के क्षय दरों का निर्धारण करने के लिए उपयोग की तकनीक पर निर्भर करता है, क्षय की दर माप या तो विश्व स्तर पर या व्यक्ति से टेप के लिए निर्धारित किया जा सकता है। खमीर एस में cerevisiae, सबसे अधिक वैश्विक mRNA के क्षय दर को मापने के लिए उपयोग किया जाता है तकनीक है कि शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय और रासायनिक transc के तापमान संवेदनशील एलील को शरण देने के एक खमीर तनाव के उपयोग में शामिलऐसे thiolutin और 1,10-phenanthroline 1-5 के रूप में riptional अवरोधकों। इन तरीकों में भी अलग-अलग mRNA के क्षय दरों चार को मापने के लिए उपयोग किया जा सकता है। अन्य तरीकों में भी mRNA के क्षय दर को मापने के लिए उपयोग किया जा सकता है। इन विधियों स्थिर राज्य लेबलिंग या केवल चुनिंदा परिस्थितियों में व्यक्त किया जाता है कि एक विनियमित प्रमोटर से व्यक्त कर रहे हैं कि mRNA के अणुओं का उपयोग करने के लिए दृष्टिकोण शामिल हैं। इन तकनीकों में से प्रत्येक कुछ फायदे और सीमाएं हैं। यहाँ वर्णित तकनीक शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय के तापमान संवेदनशील एलील का इस्तेमाल करता। इस विधि एस का उपयोग करता है cerevisiae मॉडल के रूप में, विशिष्ट ट्रांसक्रिप्शनल निषेध तकनीकों 6 का उपयोग अन्य प्रणालियों में संशोधित और उपयोग किया गया सकते हैं, लेकिन।
शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय के तापमान संवेदनशील एलील का उपयोग कर mRNA के आधा जीवन माप बड़े पैमाने पर mRNA के क्षय 4-5 के दोनों जीनोम चौड़ा और व्यक्तिगत मापन के लिए उपयोग किया जाता है। इस तकनीक में एक विशिष्ट के उपयोग की आवश्यकताशाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय, rpb1-1 एक के तापमान संवेदनशील एलील बंदरगाहों कि आईसी खमीर तनाव। इस तकनीक के लिए तर्क nonpermissive तापमान तापमान संवेदनशील खमीर तनाव के जोखिम mRNA के संश्लेषण को रोकता है। प्रतिलेखन हिचकते किया गया है के बाद बाद में, preexisting mRNA की क्षय अलग समय बिंदुओं पर नजर रखी है। preexisting mRNA की लापता होने प्रतिलेखन बंद कर दिया गया है के बाद अलग अलग समय बिंदुओं पर खमीर कोशिकाओं से शाही सेना निकालने के द्वारा नजर रखी है। खमीर कोशिकाओं काटा जाता है, जिस पर समय बिंदुओं एक पायलट प्रयोग द्वारा पूर्व निर्धारित है, और टेप और सिस्टम की जांच की जा रही है पर निर्भर कर रहे हैं। अब समय बिंदुओं अब रहते थे टेप के लिए उपयोग किया जाता है, जबकि तेज समय अंक, अल्पकालिक टेप के लिए उपयोग किया जाता है। बाद में, mRNA की क्षय या तो उत्तरी धब्बा विश्लेषण, मात्रात्मक पीसीआर या RNAseq द्वारा नजर रखी है।
एक ते का उपयोग कर mRNA के आधा जीवन का मापनशाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय के mperature संवेदनशील एलील अपने फायदे हैं। सबसे पहले, इस तकनीक को सीधे आगे आसान और है। दूसरा, खमीर तनाव mRNA के आधा जीवन माप अलग विकास की स्थिति में निर्धारित किया जा सकता प्रयोगशाला में हासिल कर ली है या उत्पन्न होता है एक बार; mRNA के क्षय पर पर्यावरणीय प्रभाव का निर्धारण को सक्षम। तीसरा, mRNA के क्षय दरों जीनोम चौड़ा नजर रखी जा सकती है। अन्य प्रतिलेखन निषेध तकनीकों का उपयोग भी फायदे और सीमाएं हैं। उदाहरण के लिए, एक inducible प्रमोटर के उपयोग विनियमित प्रमोटर के नियंत्रण में है कि एक mRNA उत्पन्न करने के लिए subcloning की आवश्यकता है। Thiolutin आसानी से उपलब्ध नहीं है और जब महंगी उपलब्ध है। इसके अलावा, कार्रवाई की thiolutin के मोड पूरी तरह से समझ नहीं है और यह mRNA के क्षय सात बाधा सहित अन्य सेलुलर प्रक्रियाओं को प्रभावित करने के लिए सूचित कर दिया गया है। वैकल्पिक रूप से, 1,10-phenanthroline, अधिक आसानी से उपलब्ध है। इसके अलावा, तकनीक के सभी गुस्ताख़ सकते प्रतिलेखन को बाधित करने के लिए इस्तेमाल कियासेलुलर समारोह URB और अलग तरीकों से अलग mRNAs को प्रभावित कर सकते हैं। एक अन्वेषक सबसे विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए अपने प्रयोगात्मक परिस्थितियों में उपयोग करने के लिए सबसे उपयुक्त तरीका निर्धारित करने की जरूरत है। उनके आवेदन के लिए सबसे उपयुक्त है जो विधि का निर्धारण करने के लिए, एक शोधकर्ता जांच की जा रही टेप द्वारा इनकोडिंग प्रोटीन के टेप और समारोह की पहचान करने की जरूरत है। सबसे विश्वसनीय mRNA के क्षय की दर माप कई तकनीकों का उपयोग करते हुए और एक ही क्षय की दर दिखाने निर्धारित कर रहे हैं कि उन लोगों के हैं। कोई भी तकनीक हमेशा सबसे अच्छा है, और सबसे उपयुक्त तकनीक विशिष्ट स्थिति पर निर्भर करता है।
एस में कई अध्ययनों cerevisiae विभिन्न स्थितियों और आनुवंशिक पृष्ठभूमि में mRNA क्षय दरों मापा है। mRNA के क्षय दरों में मापा जाता है कि शर्तों के विशिष्ट प्रयोग की जांच की जा रही है पर निर्भर करते हैं। शर्तों जा रहा है कि क्या अलग सेलुलर वातावरण में mRNA क्षय दर को मापने निर्धारित करता हैअधिमान्यतया विशिष्ट mRNAs का क्षय दरों को प्रभावित की जांच की। mRNAs का क्षय दरों में भी इस्तेमाल किया जा रहा खमीर तनाव के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, mRNA के क्षय दरों में एक nonfunctional बकवास की मध्यस्थता mRNA के क्षरण (एनएमडी) मार्ग के साथ जंगली प्रकार खमीर कोशिकाओं और खमीर कोशिकाओं में निर्धारित किया जा सकता है। इस mRNA गिरावट मार्ग अब तक की जांच की गई है कि सभी यूकेरियोटिक जीवों में पाया जाता है और यह समय से पहले ही अनुवाद 8 समाप्त कि mRNAs का क्षरण हो सके। एनएमडी शुरू में समयपूर्व समाप्ति codons या बकवास codons साथ mRNAs degrades कि एक मार्ग के रूप में पहचान की थी, लेकिन अब भी प्राकृतिक mRNAs युक्त गैर बकवास की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है कि एक मार्ग के रूप में मान्यता प्राप्त है। मार्ग का लक्ष्य कर रहे हैं कि mRNAs तेजी से एक कार्यात्मक एनएमडी मार्ग के साथ खमीर कोशिकाओं में अपमानित और एक nonfunctional एनएमडी मार्ग के साथ खमीर कोशिकाओं में स्थिर हो जाता है। इस प्रकार, इस मार्ग का सीधा लक्ष्य कर रहे हैं कि mRNAs का आधा जीवन जंगली प्रकार खमीर सेल में कम कर रहे हैंएक nonfunctional एनएमडी मार्ग के साथ खमीर कोशिकाओं की तुलना में रास।
Protocol
Representative Results
Discussion
MRNA के संश्लेषण और नई संश्लेषण के अभाव में mRNA कारोबार की निगरानी के निषेध अक्सर mRNA के क्षय दर को मापने के लिए किया जाता है कि एक विधि है। एस में cerevisiae, शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय के तापमान संवेदनशील ए?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in the author’s laboratory is supported by the Texas Higher Education Coordinating Board’s Norman Hackerman Advanced Research Program and start-up funds from Baylor University.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| High Speed Centrifuge | Eppendorf | 22628169 | |
| Mini Centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Genescreen Plus membrane | PerkinElmer | 50-905-0169 | |
| Hybridization Oven | Fisher Scientific | 95-0030-01 | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-8000 | |
| Phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-78 | |
| Typhoon phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | 29004080 | |
| UV cross-linker | GE Healthcare Life Sciences | 80-6222-31 | Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80° for 1 hour |
| NorthernMax prehybridization/hybridization buffer | Life Technologies | AM8677 | |
| Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation | Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background | ||
References
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