Måling av mRNA Decay priser i<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Bruke<em> Rpb1-1</em> Stammer
Summary
Steady state nivået av spesifikke mRNA bestemmes av graden av syntese og nedbrytning av mRNA. Genom mRNA nedbrytningshastigheter eller forfallet priser av spesifikke mRNA kan måles ved å bestemme mRNA halveringstider. Denne protokollen fokuserer på måling av mRNA dempefaktorer i Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
mRNA steady state nivåer varierer avhengig av miljøforhold. Regulering av steady state opphopning nivåer av et mRNA sikrer at den riktige mengden av protein blir syntetisert for cellens spesifikke vekstbetingelser. En fremgangsmåte for måling av mRNA-dempefaktorer er å inhibere transkripsjon og deretter overvåke forsvinningen av den allerede foreliggende mRNA. Hastigheten av mRNA-nedbrytning kan deretter kvantifiseres, og en nøyaktig halveringstid kan bestemmes anvendelse av flere teknikker. I S. cerevisiae, protokoller som måler mRNA halveringstider er utviklet og inkluderer hemme transkripsjon av mRNA ved hjelp av stammer som havn en temperaturfølsom allel av RNA polymerase II, rpb1-1. Andre teknikker for måling av mRNA-halveringstider inkluderer inhibering transkripsjon med transkripsjonelle inhibitorer så som thiolutin eller 1,10-fenantrolin, eller alternativt ved anvendelse av mRNA som er under kontroll av en regulerbar promotorslik som galaktose induserbar promoter og den TET-off-system. Her beskriver vi måling av S. cerevisiae mRNA dempefaktorer ved hjelp av temperaturfølsomme allelet av RNA polymerase II. Denne teknikken kan brukes til å måle mRNA forfallet priser av individuelle mRNA eller genom-wide.
Introduction
Transkripsjon og nedbrytning av spesifikke mRNA er avgjørende faktorer som bestemmer genuttrykk. Hastigheten for syntese og nedbrytning av spesifikke mRNA bestemmer steady-state nivå av den aktuelle mRNA. De stabile nivåer av mRNA styrer overflod av mRNA og bestemme hvor mye av hver mRNA er tilgjengelig for proteinsyntese. Målinger av mRNA halveringstider er i utstrakt bruk for å bestemme forfallet rate av mRNA. Spesifikk mRNA nedbrytning med forskjellige hastigheter som er relatert til funksjonene i mRNA, funksjonen av proteinet kodet for av mRNA og miljøforhold. Avhengig av teknikken benyttes til å avgjøre mRNA dempefaktorer, kan forfallet måling bestemmes enten globalt eller for enkelt transkripsjoner. I gjær S. cerevisiae, de teknikkene som er mest brukt til å måle global mRNA decay priser inkluderer benytte en gjærstamme husing temperaturen sensitive allelet av RNA polymerase II og kjemisk Transcriptional inhibitorer så som thiolutin og 1,10-fenantrolin 1-5. Disse fremgangsmåter kan også benyttes for å måle individuelle mRNA dempefaktorer 4. Andre metoder kan også benyttes til å måle mRNA dempefaktorer. Disse metodene inkluderer tilnærming til stabil tilstand merking eller utnyttelse av mRNA molekyler som er uttrykt fra en regulert promoter som blir uttrykt bare i utvalgte betingelser. Hver av disse teknikkene har visse fordeler og begrensninger. Teknikken som beskrives her utnytter temperaturfølsomme allelet av RNA polymerase II. Denne metoden bruker S. cerevisiae som modell, men kan blitt modifisert og brukt i andre systemer ved hjelp av spesifikke transkripsjons hemming teknikker 6.
mRNA halveringstid målinger ved hjelp av temperaturfølsomme allelet av RNA polymerase II er i utstrakt bruk for både genom-wide og individuelle målinger av mRNA forfall 4-5. Denne teknikk krever bruk av en specific gjærstamme som havner en temperaturfølsom allel av RNA polymerase II, rpb1-1 en. Begrunnelsen for denne teknikken er at eksponeringen av det temperaturfølsomme gjærstamme til nonpermissive temperatur hemmer mRNA-syntese. Deretter blir nedbrytning av den allerede eksisterende mRNA overvåket ved forskjellige tidspunkter etter transkripsjon er blitt inhibert. Forsvinningen av forhåndsdefinert mRNA blir overvåket ved å ekstrahere RNA fra gjærcellene ved ulike tidspunkt etter transkripsjon har blitt slått av. De tidspunkter ved hvilke gjærcellene er høstet er forhåndsbestemt av en pilotforsøk, og er avhengig av transkripsjonene og systemet som undersøkes. Raskere tidspunkter brukes for kortvarige transkripsjoner, mens lengre tids poeng kan brukes til lengre levd transkripsjoner. Etterpå blir nedbrytning av mRNA overvåkes enten ved Northern blot-analyse, kvantitativ PCR eller RNAseq.
Måling av mRNA halveringstider ved hjelp av en temperature følsom allel av RNA-polymerase II har sine fordeler. Først, er enkelt og rett frem denne teknikken. For det andre, når gjærstamme er ervervet eller generert i laboratoriet på mRNA-halverings målinger kan bestemmes på forskjellige vekstbetingelser; muliggjør bestemmelse av miljø innflytelse på mRNA råte. For det tredje kan mRNA dempefaktorer overvåkes genome-wide. Bruk av andre transkripsjon hemming teknikker har også fordeler og begrensninger. For eksempel bruk av en induserbar promoter krever subkloning å generere et mRNA som er under kontroll av den regulerte promoter. Thiolutin er ikke lett tilgjengelig og er dyrt når det er tilgjengelig. I tillegg er thiolutin sin virkningsmekanisme ikke helt forstått, og det har blitt rapportert å påvirke andre cellulære prosesser, inkludert hemme mRNA forfall 7. Alternativt kan 1,10-fenantrolin, er lettere tilgjengelig. Videre er alle de teknikker som anvendes for å inhibere transkripsjon kan pertUrb cellular funksjon og kan påvirke ulike mRNA i forskjellige måter. En etterforsker må bestemme den mest hensiktsmessige metoden å bruke i sine eksperimentelle forhold til å oppnå de mest pålitelige resultater. Å avgjøre hvilken metode som er mest egnet for deres søknad, trenger en forsker å identifisere utskrifter og funksjon av proteiner kodet av transkripsjoner under etterforskning. De mest pålitelige mRNA forfall måling er de som er fastsatt ved bruk av flere ulike teknikker og viser den samme forfallet rate. Ingen enkel teknikk er alltid den beste, og den mest hensiktsmessige teknikken er avhengig av den konkrete situasjonen.
Tallrike studier i S. cerevisiae har målt mRNA dempefaktorer i ulike forhold og genetiske bakgrunn. De forholdene som mRNA dempefaktorer er målt i avhenge av den spesifikke eksperiment under etterforskning. Måle mRNA dempefaktorer i ulike cellulære miljøer avgjør om vilkårene blirundersøkt fortrinnsvis påvirke forfallet priser av spesifikke mRNA. Dempefaktorer mRNA kan også variere avhengig av gjærstammen som brukes. For eksempel kan mRNA forfallet prisene bestemmes i villtype gjærceller og gjærceller med en ikke-fungerende tull-mediert mRNA nedbrytning (NMD) veien. Dette mRNA degradering veien finnes i alle eukaryote organismer som har blitt undersøkt så langt, og det utløser degradering av mRNA som tidlig avslutte oversettelse 8. NMD ble først identifisert som en vei som degraderer mRNAs med tidlig avslutning kodonene eller tull kodon, men er nå anerkjent som en vei som også regulerer uttrykket av non-nonsense inneholder naturlige mRNA. mRNA som er mål for veien blir raskt nedbrutt i gjærceller med en funksjonell NMD sti og stabilisert i gjærceller med en ikke-fungerende NMD sti. Således er halveringstiden av mRNA som er direkte mål av denne reaksjonsveien er kortere i villtype gjær cells sammenlignet med gjærceller med en ikke-fungerende NMD sti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemming av mRNA-syntese og overvåking mRNA omsetning i fravær av ny syntese er en metode som ofte brukes til å måle mRNA dempefaktorer. I S. cerevisiae, måling av mRNA dempefaktorer ved å hemme transkripsjon ved hjelp av temperaturfølsomme allel av RNA-polymerase II er en av de mest brukte metoder. Denne metoden spesifikt hemmer RNA polymerase II. De mest kritiske trinnene for bestemmelse av mRNA dempefaktorer ved hjelp av denne teknikken er: 1) Før høsting av gjærceller, sikre at transkripsjon er sl?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in the author’s laboratory is supported by the Texas Higher Education Coordinating Board’s Norman Hackerman Advanced Research Program and start-up funds from Baylor University.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| High Speed Centrifuge | Eppendorf | 22628169 | |
| Mini Centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Genescreen Plus membrane | PerkinElmer | 50-905-0169 | |
| Hybridization Oven | Fisher Scientific | 95-0030-01 | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-8000 | |
| Phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-78 | |
| Typhoon phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | 29004080 | |
| UV cross-linker | GE Healthcare Life Sciences | 80-6222-31 | Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80° for 1 hour |
| NorthernMax prehybridization/hybridization buffer | Life Technologies | AM8677 | |
| Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation | Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background | ||
References
- Nonet, M., Scafe, C., Sexton, J., Young, R. Eukaryotic RNA polymerase conditional mutant that rapidly ceases mRNA synthesis. Mol. Cell. Biol. 7, 1602-1616 (1987).
- Santiago, T. C., Purvis, I. J., Bethany, A. J., Brown, A. J. The relationship between mRNA stability and length in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 14 (21), 8347-8360 (1986).
- Jimenez, A., Tipper, D. J., Davies, J. Mode of action of thiolutin, an inhibitor of macromolecular synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Antimicrob Agents Chemother. 3 (6), 729-738 .
- Herrick, D., Parker, R., Jacobson, A. Identification and Comparison of stable and unstable mRNAs in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 10 (5), 2269-2284 .
- Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. Genome-wide Analysis of mRNA Stability Using Transcription Inhibitors and Microarrays Reveals Postranscriptional Control of Ribosome Biogenesis Factors. Mol Cell Biol. 24 (12), 5534-5547 (2004).
- Tani, H., Akimitsu, N. Genome-wide technology for determining RNA stability in mammalian cells. RNA Biology. 9 (10), 1233-1238 (2012).
- Pelechano, V., Perez-Ortin, J. E. The transcriptional inhibitor thiolutin blocks mRNA degradation in yeast. Yeast. 25, 85-92 (2008).
- Kervestin, S., Jacobson, A. NMD: a multifaceted response to premature translational termination. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 700-712 (2012).
- Kolodziej, P. A., Woychik, N., Liao, S. M., Young, R. A. RNA Polymerase II subunit composition, stoichiometry and phosphorylation. Mol Cell Biol. 10 (5), 1270-1275 (1990).
- Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1998).
- Kebaara, B. W., Nazarenus, T., Taylor, R., Atkin, A. L. Genetic background affects relative nonsense mRNA accumulation in wild-type and upf mutant yeast strains Current Genetics). 43, 171-177 (2003).
- Kebaara, B. W., Baker, K. E., Patefield, K. D., Atkin, A. L. Analysis of Nonsense-Mediated mRNA Decay in Saccharomyces cerevisiae. Current Protocols in Cell Biology. 27 (27.3), 27.3.1-27.3.39 (2012).
- Hu, W., Coller, J. Methods for measuring mRNA Decay Rate in Saccharomycescerevisiae. Methods in Enzymology. 530, 137-155 (2013).
