蛋白质聚集体的朊病毒样传播最近被发现与多种神经退行性疾病相关。本实验方案的目的是介绍如何利用线虫 C. elegans 作为模式系统来监测蛋白质的扩散，并研究朊病毒样现象。
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本文内容
摘要
摘要
朊病毒是一类非传统的、可自我传播的蛋白质颗粒，不含任何编码核酸。这些蛋白质种子可作为模板，介导其良性细胞异构体的构象转换与复制。越来越多的证据表明，许多蛋白质聚集体可作为自我传播的模板，并诱导同源蛋白质发生错误折叠。尽管在某些情况下聚集体具有功能作用，但这一过程通常会破坏细胞内的蛋白质稳态（蛋白稳态），最终导致阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、肌萎缩侧索硬化症（ALS）或传染性海绵状脑病（TSEs）等毁灭性疾病。目前，关于朊病毒传播机制以及蛋白质聚集体在细胞间扩散的具体过程仍在深入研究之中。为了进一步推动该领域的认知，近期已建立了一种在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中表达酵母细胞质朊病毒蛋白Sup35朊病毒结构域的多细胞动物模型。该朊病毒模型具有多项优势，例如可在活体动物中直接监测荧光标记的朊病毒结构域，并便于开展遗传学研究。本文所述方法可用于研究蛋白质聚集体的类朊病毒行为，并利用C. elegans鉴定调控朊病毒诱导毒性的相关因子。
引言
许多神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、肌萎缩侧索硬化症（ALS）和传染性海绵状脑病（TSEs），均与易于聚集的蛋白质相关，因此统称为蛋白质错误折叠疾病（PMDs）。TSEs 或朊病毒疾病是一类独特的 PMDs，因其在人类和动物中均具有传染性1。在分子水平上，朊病毒通过招募并转化单体形式、富含α-螺旋的宿主编码细胞型PrP（PrPC）成为富含β-折叠的致病型PrPSc构象来实现自我复制2,3。自我传播的蛋白质聚集体也在真菌中被发现，其具有与哺乳动物朊病毒相似的重要特征4,5。此外，哺乳动物朊病毒能够在细胞间传播并感染未受感染的细胞6,7。
尽管除TSEs以外的PMDs不具有传染性，但它们与朊病毒疾病具有一种共同的致病机制8,9尽管与每种PMDD相关的蛋白质在结构或功能上并无关联，但它们均通过一种类似结晶的过程（称为成核或种子化聚合）形成聚集体；此外，这些蛋白质种子通过招募其可溶性同种异型体而不断生长。2,10,11自我增殖的效率存在差异 体内，取决于蛋白质的内在特性，这些特性与分子伴侣等其他细胞因子共同最终决定了聚集体的成核、接种、断裂和扩散速率12-15因此，这些因素之间必须存在一种精细的平衡，以实现蛋白质聚集的高效传播。这也可能解释为何....
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方案
1. 通过跨细胞传播监测类朊病毒蛋白 体内 延时成像
注意：培养 秀丽隐杆线虫 野生型（WT）（N2）及转基因品系，按照标准方法培养，并严格控制培养温度47.
- 生成转基因品系 秀丽隐杆线虫 表达带有单体红色荧光蛋白（mRFP）标签的类朊病毒蛋白。观看此视频，了解如何使用显微注射技术48有关整合这些染色体外品系的更多详细信息和方法，请参见49.
- 根据标准方法通过产卵或漂白制备同步化群体50.
- 通过产卵进行同步化
- 将10 - 20只怀卵成虫转移至培养皿中，让其产卵1 - 2小时。移除成虫，让后代在培养皿中生长至所需年龄。
- 漂白同步化
- 收集未同步的成年 gravid 线虫群体，用碱性次氯酸盐溶液（250 mM NaOH 和商用漂白剂在 H₂O 中 1:4 (v/v) 稀释）处理2O). 用M9缓冲液洗涤卵子两次（218 × g，1分钟）47 (21 mM Na2HPO4·7H2O₂, 22 mmol/L KH2PO4....
- 通过产卵进行同步化
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结果
通过监测类朊病毒蛋白的细胞间扩散 体内 延时成像
转基因 C. elegans 表达朊病毒结构域的细胞系特别适用于对类朊病毒蛋白某些方面的分析， 例如，细胞间传播以及非细胞自主毒性。动物的透明性使得能够在整个生命周期的各个阶段，在活体生物体内追踪荧光标记的蛋白质。利用这一特性，可通过荧光显微镜观察类朊病毒蛋白在细胞和组织间的移动。必须使用63X或100X/1.4NA油镜物镜，以清晰分辨囊泡结构。重要的是，朊病毒结构域必须用mRFP标记，以便在这些可能呈酸性的囊泡中保持荧光可见性40黄色荧光蛋白（YFP）常被用作标签，但由于其在低pH环境中会发生荧光淬灭，因此不适用。40,55菌株 AM815 表达带有 RFP 标签的 R2E2（一种高度易于聚集且具有毒性的朊病毒结构域 NM 的形式），该蛋白会积聚在管状囊泡中，而单独的 RFP 标签则保持可溶状态图1A.......
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讨论
本文所述方法有助于阐明类朊病毒蛋白的扩散行为及其复杂的细胞自主性和非细胞自主性毒性。我们最近发现，一个易于聚集的细胞质朊病毒结构域可通过一种与自噬相关的过程被摄入膜结合囊泡中。其中特定亚群的囊泡可在细胞内以及细胞与组织之间运输该朊病毒结构域40。在活体动物中监测这些囊泡运动的关键在于，目标蛋白必须标记mRFP，因为只有标记mRFP的蛋白才能在这些可能呈酸性的囊泡中被观察到。采用相同方法，我们目前正在研究某些与疾病相关的蛋白是否具有潜在的类朊病毒特性，例如超氧化物歧化酶1（SOD1）（与肌萎缩侧索硬化症ALS相关）、α-突触核蛋白（与帕金森病PD相关）或TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）（与ALS相关）。尽管这种囊泡介导的细胞间运输可能也被其他多种蛋白所利用，但仍可能存在其他促进扩散的途径。
使用特征明确的折叠传感器是监测 C. elegans 细胞内蛋白质折叠环境变化的有力工具63-66。本文展示了如何利用在组织特异性启动子驱动下表达的荧光标记易聚集蛋白，通过其随年龄增长的累积情况，实现对不同组织折叠能力的可视化.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
感谢Cindy Voisine和Yoko Shibata对本文手稿提出的有益讨论和宝贵意见。感谢西北大学高通量分析实验室（HTAL）和生物成像中心（BIF）提供的协助。本研究由美国国立卫生研究院（NIGMS、NIA、NINDS）、艾略特医学基金会以及丹尼尔·F·和阿达·L·赖斯基金会（资助对象：R.I.M.）提供的资助支持。C.I.N.-K. 受德国研究基金会（KR 3726/1-1）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| 纳米球尺寸标准 100 nm | 赛默飞世尔科技 | 3100A | |
| 左旋咪唑 | Sigma | L-9756 | |
| IPTG | Sigma | 15502-10G | |
| Ahringer RNAi文库 | 来源 生物科学 生命科学 | http://www.lifesciences.sourcebioscience .com/克隆产品/非哺乳动物/秀丽隐杆线虫/秀丽隐杆线虫RNAi文库/ | |
| 设备 | |||
| Sorvall Legend XTR 制冷离心机，120 VAC | 赛默飞世尔科技 | 75004521 | http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_ XTR_制冷离心机_120 VAC/EW-17707-60 |
| 96针复制器 | Scionomix | http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/ | |
| HiGro 高容量恒温培养摇床 | Digilab | http://www.digilabglobal.com/higro | |
| Multidrop Combi 试剂分配器 | Titertrek | http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm | |
| Biomek FX AP96 自动化工作站 | Beckman Coulter | http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm | |
| Innova44 摇床 | 新不伦瑞克 | http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec 04&action=products&内容编号=1& catalognode=83389 | |
| M205 FA | Leica | http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/ | |
| ORCA-R2 C10600-10B 数字化 CCD 相机 | 滨松 | http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html | |
| 转盘共聚焦显微镜 | Leica | http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/ | |
| Falcon 4M60 相机 | Teledyne Dalsa | http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/ | |
| 软件 | |||
| MetaMorph 显微镜自动化 & 图像分析软件 | Molecular Devices | http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html | |
| 滨松 SimplePCI 图像分析软件 | Meyer Instruments | http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm | |
| ImageJ | 美国国立卫生研究院 | http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html | |
| ImageJ 的 wrMTrck 插件 | http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html | ||
| 秀丽隐杆线虫 品系 | |||
| N2（野生型） | 秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC） | http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570 | |
| AM815 rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp] | Morimoto 实验室 | 可从本实验室获取 | |
| 参见表1获取折叠传感器和应激报告基因品系的来源 |
参考文献
- Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
- Jarrett, J. T., Lansbury, P. T. Seeding 'one-dimensional crystallization' of amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer's disease and scrapie.....
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