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Biology

후생 동물 모델 생물을 사용하여 확산 및 독성 프리온 같은 단백질을 조사<em> C. 엘레</em

Published: January 08, 2015
doi:
10.3791/52321
, , , ,
1Department of Molecular Biosciences, Rice Institute for Biomedical Research,Northwestern University

Summary

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

Abstract

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer’s disease (AD), Parkinson’s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Introduction

알츠하이머 병 (AD), 파킨슨 병 (PD), 근 위축성 측삭 경화증 (ALS) 및 전염성 해면상 뇌증 (TSEs)를 포함한 많은 신경 변성 질환, 응집하기 쉬운 단백질과 연관되어 있고, 따라서 집합 적 단백질 미스 폴딩 장애 (즉 PMD라고도 ). 그들은 모두 인간과 동물 (1)에 감염 될 수 있다는 점에서 TSEs 또는 프리온 질병은 PMD를 독특한 클래스를 구성한다. 분자 수준에서, 프리온은 모집 및 병리학 적 β-시트 풍부한 PRP 사우스 캐롤라이나 형태 2,3에 단량체 α 나선이 풍부한 호스트 인코딩 세포 PRP (PRP C)를 변환하여 복제합니다. 자체 전파 단백질 응집체는 포유 동물의 프리온 4,5으로 중요한 특성을 공유 곰팡이에서 확인되었다. 또한 프리온은 포유류 세포 간에서 이동할 수 있으며 6,7 나이브 세포를 감염.

즉 PMD의 OTH 동안어 TSEs는 전염성이없는 것보다, 그들은 프리온 질환 8,9와 공통 병원성 원칙을 공유 할 수 있습니다. PMD를 각각에 연결된 단백질 구조 또는 기능에 관련되지는 않지만, 그들은 결정화와 같은 과정을 통해 모든 형태의 집계는 핵이라고 또는 중합 시드; 또한 단백질 씨는 수용성 이소 2,10,11 모집에 의해 성장한다. 자기 전파 효율이 함께 같은 분자 샤페론 같은 추가적인 요인 궁극적으로 세포 집합체 핵 시딩 단편화 및 12-15의 확산 속도를 결정하는 단백질의 고유 특성에 따라, 생체 내에서 변화한다. 따라서, 단백질 응집을 효율적으로 전파 할 수 있습니다 이러한 요인들 사이에서 좋은 균형이 존재해야한다. 일부 아밀로이드 응집체가 프리온의 특성을 항구, 따라서 모든 PMD가이 전염성이있는 이유도 설명 할 수 있습니다. 프리온은 '최고의 공연'O를 대표하는 것그들에게 PMD가 8, 13을 연구 할 수있는 강력한 도구를 만드는 자기 복제 단백질 집합체의 FA 다양한 스펙트럼.

흥미롭게도, 질병 관련 집계와 관련된 독성은 종종 비 셀 자율적 인 구성 요소 (16, 17)이있다. 이것은 그들이 단지 세포 유전자 전시에게 특정 표현형을 발현하는 것을 의미 엄격 셀 자율적 효과와는 달리, 해당 유전자를 발현하지 않는 인접 셀에 영향을 미치는 것을 의미한다. 이것은 강력하게 조직 – 특이 적 발현에 의해 증명 또는 신경 퇴행성 질환 18 ~ 26의 다양한 모델의 각 단백질의 노크했다. 다양한 메커니즘 점감 영양 공급, 신경 신호 불균형, 글루타메이트 흥분 독성 (excitotoxicity), 및 신경 염증 16,27,28 포함 PMD가이 비 – 자율적 인 세포 독성의 기초로 제안되어왔다. 또한, 질환 세포 간의 결합 된 응집체의 프리온 같은 운동 might이면 (29, 30)에 기여한다. 증가 증거는 프리온이 아닌 다른 단백질 흠이 특성은 여러 가지 PMD 30-36에서 관찰되는 병리의 확산을 설명 할 수있는 세포 간에서 송신 할 수 있음을 시사한다. 그러나, 아직 질환 단백질의 세포 내 이동 및 이웃 셀에 대한 독성 효과 사이의 명확한 인과 관계가 있는지를 판정해야한다. 따라서, 셀 간 전송 및 비 자율 세포 독성의 기초 세포질 통로의 더 나은 이해는 신규 치료법의 개발이 필요하고 필수적이다. 그러나, 후생 동물에 잘못 접힌 단백질의 세포 간 전송에 영향을 미칠 확산 및 세포 인자 프리온 등의 여러 측면이 아니라 생명체의 수준에서, 특히 이해되지 않습니다.

예쁜 꼬마 선충 선충은 잠재력을 제공하는 몇 가지 장점이 있습니다 프리온 같은 spreadi의 새로운면을 발견후생 동물 17 ng를. 이는 생체가 생체에서의 형광 태그로 단백질을 추적 가능 투명하다. 또한, 질병에 의해 영향을받는 많은 세포 및 생리 학적 과정은 인간에 웜으로부터, 그리고 C.된다 엘레 또한 유전자 조작 및 분자 생화학 적 분석 37 ~ 39의 다양한 의무입니다. 정확히 959 체세포는 여전히 근육, 신경 및 대장 등 여러 가지 별개의 조직 유형을 가지고 간단한 몸 계획을 가지고있는 성인 자웅 동체를 구성합니다.

C. 새로운 프리온 모델을 설정하려면 엘레, 우리는 벌레 4,40에는 알려진 내생 프리온 단백질이 없기 때문에 외생 적, 잘 특징 글루타민 / 아스파라긴 (Q / N) 세포질 효모 프리온 단백질 Sup35의이 풍부한 프리온 도메인 NM을 표현하기로 결정했습니다. 효모 프리온은 프리온 복제 41 ~ 44의 기본 메커니즘을 밝히는데 귀중한왔다. 또한, NM은 전나무이다포유 동물 세포 배양 물 45, 46에서 프리온의 전체 라이프 사이클 요점을 되풀이하는 것으로 나타났다 세포질 성 단백질 프리온 등. 마찬가지로, C로 표시 할 때 엘레, 미토콘드리아 무결성 및 외관의 중단을 포함하여 40. NM 집계가 깊은 독성 표현형와 관련이 효모 세포 프리온 생물학의 전시 주요 기능에 비해 후생 동물 세포에서의 전파에 대한 다양한 요구 사항에 매우 잘 채택 Sup35 프리온 도메인 세포 수준과 관련된 다양한 자식 작용 소체뿐만 아니라 배아와 유충 마비, 발달 지연과 유기체 레벨에 단백질 접힘 환경 교란 광범위. 놀랍게도, 프리온 도메인 유전자가 발현되지 않은 인접 조직에 영향을 미치는 세포 자율 및 비 자율 세포 독성을 나타낸다. 또한, 내부 및 셀간 프리온 도메인 소낭 수송 실시간 모니터링된다 <EM> 생체 (40).

여기에서 우리는 C.에서 프리온 등의 보급을 검사하는 방법에 대해 설명합니다 엘레. 우리는 시간 경과 형광 현미경을 이용하여 프리온 도메인을 함유 소포 인트라 및 세포 간 수송을 모니터링하는 방법을 설명 할 것이다. 우리는 조직 – 특이 폴딩 센서의 사용을 강조 편재 셀룰러 니스에 셀 자율 및 비 자율 셀에 미치는 효과를 평가하기 위하여, 응력 기자를 표현한다. 마지막으로, 우리는 프리온 – 유도 독성의 새로운 개질제를 식별하기 위해 최근에 수행 넓은 게놈 RNA 간섭 (RNAi의) 화면의 순서를 설명한다. 조합, 이러한 방법은 단백질의 세포 간 이동 및 그 이외의 세포 자율 독성에 관여하는 유전 적 경로를 떨어져 애타게하는 데 도움이 될 수 있습니다.

Protocol

1. 모니터링 세포 횡단는 생체 시간 경과 영상으로 프리온 같은 단백질의 확산 참고 : C. 성장 표준 방법에 조심스럽게 재배 온도 (47)를 제어에 따라 elegans의 야생형 (WT) (N2)와 유전자 변형 라인. C.의 유전자 변형 라인을 생성 엘레 단량체 적색 형광 단백질 (MRFP) 태그 프리온 같은 단백질을 표현. 미세 주입 (48)를 사용하…

Representative Results

생체 시간 경과 영상에 의해 프리온 같은 단백질의 확산 세포 간 모니터링 형질 전환 C. 프리온 도메인을 발현 간스 라인 형상의 프리온 단백질, 예를 들면 세포 간 전송 및 비 자율 세포 독성의 특정 양상의 분석에 특히 적합하다. 수의 형광 추적 동물의 투명성은 삶의 모든 단계에서 생체 내에서 단백질을 태그. 이것의 활용, 세포 형광…

Discussion

여기에 설명 된 방법은 확산 예시 도와 같은 프리온 단백질의 조립 전지 자율 및 비 독성 세포 자율. 우리는 최근에 집계가 발생하기 쉬운 세포질 프리온 도메인이 자식 작용과 관련된 과정에 막 결합 소포로 흡수되는 것을 발견했다. 이러한 소체의 특정 서브 세트 내에서 세포 및 조직과 40 사이 프리온 도메인을 수송한다. 살아있는 동물에서의 움직임을 모니터링하는 키는 단백질 만 MRFP …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Cindy Voisine and Yoko Shibata for helpful discussion and critical comments on the manuscript. We acknowledge the High Throughput Analysis Laboratory (HTAL) and the Biological Imaging Facility (BIF) at Northwestern University for their assistance. This work was funded by grants from the National Institutes of Health (NIGMS, NIA, NINDS), the Ellison Medical Foundation, and the Daniel F. and Ada L. Rice Foundation (to R.I.M.). C.I.N.-K. was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (KR 3726/1-1).

Materials

Reagent
Nanosphere size standards 100 nm ThermoScientific 3100A
Levamisole Sigma L-9756
IPTG Sigma 15502-10G
Ahringer RNAi library Source BioScience LifeSciences  http://www.lifesciences.sourcebioscience
.com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/
Equipment
Sorvall Legend XTR Refrigerated Centrifuge, 120VAC ThermoScientific 75004521 http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_
XTR_Refrigerated_Centrifuge_120
VAC/EW-17707-60
96 pin replicator  Scionomix   http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/
HiGro high-capacity, incubating shaker  Digilab http://www.digilabglobal.com/higro
Multidrop Combi Reagent Dispenser  Titertrek http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm
Biomek FX AP96 Automated Workstation  Beckman Coulter http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm
Innova44 shaker New Brunswick http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec
04&action=products&contentid=1&
catalognode=83389
M205 FA  Leica http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/
ORCA-R2 C10600-10BDigital CCD camera Hamamatsu http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html
Spinning Disc AF Confocal Microscope  Leica http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/
Falcon 4M60 camera  Teledyne Dalsa  http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/
Software
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software Molecular Devices http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html
Hamamatsu SimplePCI Image Analysis Software Meyer Instruments http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm
ImageJ NIH http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
wrMTrck plugin for ImageJ http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html
C. elegans strains
N2 (WT) Caenorhabditis Genetics Center (CGC) http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570
AM815                                                    rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp] Morimoto lab available from our laboratory 
See table 1 for a source for folding sensor and stress reporter strains
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Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans. J. Vis. Exp. (95), e52321, doi:10.3791/52321 (2015).
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