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Biology

Untersuchung der Verbreitung und Toxizität von Prion-ähnlichen Proteine ​​Mit dem Metazoan Modellorganismus<em> C. elegans</em

Published: January 08, 2015
doi:
10.3791/52321
, , , ,
1Department of Molecular Biosciences, Rice Institute for Biomedical Research,Northwestern University

Summary

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

Abstract

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer’s disease (AD), Parkinson’s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Introduction

Viele neurodegenerative Erkrankungen, einschließlich Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson-Krankheit (PD), Amyotrophe Lateralsklerose (ALS), und übertragbaren spongiformen Enzephalopathien (TSE) werden mit Aggregation neigende Proteine ​​verbunden und werden daher allgemein als Proteinfehlfaltungserkrankungen (PMDs bekannt ). TSE oder Prionenerkrankungen stellen eine einzigartige Klasse von PMDs indem sie Infektions in Mensch und Tier 1 sein kann. Auf molekularer Ebene, replizieren Prionen durch die Rekrutierung und Umwandlung von monomeren α-Helix reiche Wirts kodierten zellulären PrP (PrP C) in die pathologische β-Faltblatt-reiche PrP Sc Konformation 2,3. Selbstausbreiteproteinaggregate wurden auch in Pilzen, die wichtige Eigenschaften mit Säugetier Prionen 4,5 austauschen können. Zusätzlich sind Säuger Prionen bewegen kann, von Zelle zu Zelle und infizieren naiven Zellen 6,7.

Während PMDs other als TSE nicht infektiös sind, teilen sie sich eine gemeinsame pathogene Prinzip mit Prionenerkrankungen 8,9. Obwohl die Proteine, die jeder der PMDs verknüpft sind nicht in der Struktur oder Funktion bezogen, sie bilden alle Aggregate über eine Kristallisationsartigen Prozess namens nukleierten oder impft Polymerisation; außerdem proteinhaltigen Samen wachsen durch die Einstellung ihrer löslichen Isoformen 2,10,11. Die Effizienz der Selbst Propagate variiert in vivo in Abhängigkeit von den intrinsischen Eigenschaften des Proteins, die zusammen mit zusätzlichen zellulären Faktoren wie molekulare Chaperone bestimmen letztlich Raten Aggregat Nukleation, Säen, Fragmentierung und Ausbreiten 12-15. Daher muss es eine feine Balance zwischen diesen Faktoren, die eine effiziente Vermehrung von Proteinaggregation ermöglicht existieren. Dies könnte auch erklären, warum nur einige amyloidogenen Aggregate Hafen der Eigenschaften eines Prion und damit nicht alle PMDs sind ansteckend. Prionen scheint "Top-Performer" o vertretenfa breites Spektrum von sich selbst replizierenden proteinartige Aggregate, die ihnen ein leistungsfähiges Werkzeug zur PMDs 8,13 zu studieren.

Interessanterweise hat die Toxizität mit krankheitsbedingten Aggregaten assoziiert oft ein nicht zellautonomen Komponenten 16,17. Dies bedeutet, dass sie Nachbarzellen, die das entsprechende Gen nicht exprimieren, im Gegensatz zu einem rein Zelle autonome Wirkung, was bedeutet, daß nur die Zellen, die das Gen weisen die spezifischen Phänotyp beeinflussen. Dies wurde überzeugend von gewebespezifische Expression nachgewiesen oder knock down der entsprechenden Proteine ​​in zahlreichen Modellen neurodegenerativer Erkrankungen 18-26. Verschiedene Mechanismen wurden als Grundlage für diese nicht-zellautonomen Toxizität PMDs einschließlich vermindert Nährstoffversorgung Ungleichgewicht in neuronalen Signalisierung Glutamatexzitotoxizität und neuroinflammation 16,27,28 vorgeschlagen. Zusätzlich ist ein Prion artige Bewegung der Krankheit gebundenen Aggregate zwischen Zellen might diesem Aspekt 29,30 tragen. Zunehmende Hinweise darauf, dass andere Proteineinschlüsse als Prionen von Zelle-zu-Zelle zu übertragen, was erklären kann, die charakteristische Verteilung der Pathologie in vielen PMDs 30-36 beobachtet. Es hat sich jedoch noch nicht bestimmt werden, ob es einen klaren ursächlichen Zusammenhang zwischen interzelluläre Bewegung Krankheit Proteine ​​und die toxische Wirkung auf Nachbarzellen. Daher ist ein besseres Verständnis der zellulären Wege, die Zell-zu-Zell-Übertragung und nicht zellautonomen Toxizität zugrunde notwendig und wesentlich für die Entwicklung neuartiger Therapeutika. Allerdings sind viele Aspekte der Prionartigen Ausbreitung und zellulären Faktoren, die Zell-zu-Zell-Übertragung von fehlgefalteten Proteinen Metazoen beeinflussen nicht gut verstanden, insbesondere auf der Ebene der Organismen.

Der Nematode Caenorhabditis elegans hat mehrere Vorteile, die das Potential bieten entdecken Sie neue Facetten des Prion-ähnlichen spreading in Metazoen 17. Es ist transparent, so dass für in vivo-Tracking von fluoreszenzmarkierten Proteine ​​im lebenden Organismus. Darüber hinaus werden viele zelluläre und physiologische Prozesse durch Krankheit betroffen von Würmern die menschliche konserviert und C. elegans eignet sich auch für eine Vielzahl von genetischen Manipulationen und molekularen und biochemischen Analysen 37-39. Genau 959 Körperzellen bilden die erwachsenen Hermaphroditen mit einem einfachen Körper Plan, der noch mehrere verschiedene Gewebearten, einschließlich Muskeln, Neuronen und Darm hat.

Um eine neue Prion-Modell in C zu etablieren elegans, entschieden wir uns für exogen drücken die gut charakterisiert Glutamin / Asparagin (Q / N) -reichen Prion Domain NM der cytosolischen Hefe-Prion-Protein Sup35, da gibt es keine bekannten endogenen Prion-Proteine ​​in Würmern 4,40. Hefe Prionen waren von unschätzbarem Wert bei der Aufklärung grundlegender Mechanismen von Prionenreplikation 41-44. Darüber hinaus ist die Tanne NMst cytosolische Prion-ähnliches Protein, die gezeigt wurde, um den gesamten Lebenszyklus eines Prion in Säugetierzellkulturen 45,46 rekapitulieren. Ebenso wird, wenn in C exprimiert elegans, die hervorragend an die unterschiedlichen Anforderungen für die Vermehrung in Metazoen-Zellen im Vergleich zu Hefezellen und wiesen Merkmale von Prion biology 40. NM Aggregation wurde mit einem tiefen toxischen Phänotyp verbunden sind, einschließlich der Störung der mitochondrialen Integrität und das Aussehen angenommen Sup35 Prion Domäne verschiedene Autophagie bezogenen Vesikel auf zellulärer Ebene sowie embryonale und larvale Stillstand, Entwicklungsverzögerung, und eine weit verbreitete Störung der Proteinfaltung Umgebung auf der organismischen Ebene. Auffallend ist, dass das Prion-Domain weist Zell autonomen und nicht autonomen Zelltoxizität, Auswirkungen auf benachbarte Gewebe, bei denen das Transgen nicht ausgedrückt. Ferner ist der vesikulären Transport des Prion Domäne innerhalb und zwischen den Zellen in Echtzeit überwacht <em> In-vivo-40.

Hier beschreiben wir, wie man Prion-ähnlichen Verbreitung in C prüfen elegans. Wir werden erklären, wie die intra- und interzellulären Transport von Vesikeln, die das Prion-Domäne mit Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie zu überwachen. Wir werden die Verwendung von gewebespezifischen Klapp Sensoren unterstreichen und ubiquitär exprimiert Stress Reportern zu Zelle autonomen und nicht autonomen Zell Effekte auf zellulärer Fitness zu bewerten. Schließlich werden wir den Ablauf einer vor kurzem durchgeführt genomweiten RNA-Interferenz (RNAi) Bildschirm beschreiben, neue Modifikatoren von Prion-induzierte Toxizität zu identifizieren. In Kombination können diese Methoden helfen, necken neben genetischen Pfade in der interzellulären Bewegung von Proteinen und ihre nicht zellautonomen Toxizität beteiligt.

Protocol

1. Überwachung transzelluläre Verbreitung des Prion-ähnlichen Proteine ​​durch In-vivo-Zeitraffer-Imaging HINWEIS: Wachsen C. elegans Wildtyp (WT) (N2) und transgenen Linien nach Standardmethoden und die Kultivierungstemperatur 47 sorgfältig zu kontrollieren. Gene transgenen Linien von C elegans Expression des Prion-ähnlichen Protein, mit monomeren rot fluoreszierendes Protein (mRFP) markiert. In diesem Video, das, wie man die Mikroin…

Representative Results

Überwachung interzelluläre Ausbreitung von Prionen-ähnlichen Proteinen durch In-vivo-Zeitraffer-Bildgebung Transgenen C. elegans Linien die Prion-Domäne exprimieren, sind besonders gut für die Analyse von bestimmten Aspekten der Prion-ähnlichen Proteine, zB Zell-zu-Zell-Übertragung und nicht zellautonomen Toxizität geeignet. Die Transparenz der Tiere ermöglicht Verfolgung von fluoreszenzmarkierten Proteine ​​aus dem lebenden Organismus…

Discussion

Die hier beschriebenen Methoden helfen, um zu veranschaulichen die Verbreitung und der komplexen Zell autonomen und nicht autonomen Zelltoxizität von Prion-ähnlichen Proteinen. Wir haben vor kurzem festgestellt, dass eine Aggregation neigende cytosolische Prion-Domäne wird in membrangebundene Vesikel in einer Autophagie bezogenen Prozess übernommen. Eine spezielle Untergruppe dieser Vesikel transportiert das Prion-Domäne innerhalb und zwischen den Zellen und Gewebe 40. Der Schlüssel, um ihre Bewegung im…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Cindy Voisine and Yoko Shibata for helpful discussion and critical comments on the manuscript. We acknowledge the High Throughput Analysis Laboratory (HTAL) and the Biological Imaging Facility (BIF) at Northwestern University for their assistance. This work was funded by grants from the National Institutes of Health (NIGMS, NIA, NINDS), the Ellison Medical Foundation, and the Daniel F. and Ada L. Rice Foundation (to R.I.M.). C.I.N.-K. was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (KR 3726/1-1).

Materials

Reagent
Nanosphere size standards 100 nm ThermoScientific 3100A
Levamisole Sigma L-9756
IPTG Sigma 15502-10G
Ahringer RNAi library Source BioScience LifeSciences  http://www.lifesciences.sourcebioscience
.com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/
Equipment
Sorvall Legend XTR Refrigerated Centrifuge, 120VAC ThermoScientific 75004521 http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_
XTR_Refrigerated_Centrifuge_120
VAC/EW-17707-60
96 pin replicator  Scionomix   http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/
HiGro high-capacity, incubating shaker  Digilab http://www.digilabglobal.com/higro
Multidrop Combi Reagent Dispenser  Titertrek http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm
Biomek FX AP96 Automated Workstation  Beckman Coulter http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm
Innova44 shaker New Brunswick http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec
04&action=products&contentid=1&
catalognode=83389
M205 FA  Leica http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/
ORCA-R2 C10600-10BDigital CCD camera Hamamatsu http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html
Spinning Disc AF Confocal Microscope  Leica http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/
Falcon 4M60 camera  Teledyne Dalsa  http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/
Software
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software Molecular Devices http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html
Hamamatsu SimplePCI Image Analysis Software Meyer Instruments http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm
ImageJ NIH http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
wrMTrck plugin for ImageJ http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html
C. elegans strains
N2 (WT) Caenorhabditis Genetics Center (CGC) http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570
AM815                                                    rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp] Morimoto lab available from our laboratory 
See table 1 for a source for folding sensor and stress reporter strains
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Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans. J. Vis. Exp. (95), e52321, doi:10.3791/52321 (2015).
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