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Biology

Indagare le proteine ​​prioniche-come diffusione e tossicità di utilizzare i metazoi Organismo modello<em> C. elegans</em

Published: January 08, 2015
doi:
10.3791/52321
, , , ,
1Department of Molecular Biosciences, Rice Institute for Biomedical Research,Northwestern University

Summary

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

Abstract

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer’s disease (AD), Parkinson’s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Introduction

Molte malattie neurodegenerative, tra cui la malattia di Alzheimer (AD), malattia di Parkinson (PD), la sclerosi laterale amiotrofica (SLA), e le encefalopatie spongiformi trasmissibili (TSE), sono associati con le proteine ​​di aggregazione a rischio e sono, quindi, noti collettivamente come misfolding disturbi (PMD ). EST o malattie da prioni costituiscono una classe unica di PMD in che possono essere infettivi in entrambi gli esseri umani e gli animali 1. A livello molecolare, i prioni replicano reclutando e convertendo monomerico α-elica-ricchi PrP cellulari host-codificato (PrP C) nel patologico β-sheet-ricchi PrP Sc conformazione 2,3. Aggregati auto-propagazione della proteina sono stati individuati nei funghi, che condividono caratteristiche importanti con prioni mammiferi 4,5. Inoltre, prioni mammiferi sono in grado di muoversi da cellula-cellula e infettare le cellule naïve 6,7.

Mentre PMD OTHer di TSE non sono infettive, condividono un principio patogenetico comune con malattie da prioni 8,9. Sebbene le proteine ​​legate a ciascuna delle PMD non sono collegati in struttura o funzione, che tutti gli aggregati di forma tramite un processo di cristallizzazione simile chiamati nucleate o seminate polimerizzazione; inoltre semi proteici crescere reclutando i loro isoforme solubili 2,10,11. L'efficienza di auto-propagano varia in vivo, a seconda delle proprietà intrinseche della proteina, che insieme con fattori cellulari aggiuntive come chaperon molecolari fine determinano tassi di nucleazione aggregata, semina, frammentazione e diffusione 12-15. Quindi, deve esistere un equilibrio tra questi fattori, che permette la propagazione efficiente di aggregazione proteica. Questo potrebbe anche spiegare il motivo per cui solo alcuni aggregati amiloidogenici ospitano le caratteristiche di un prione, e, quindi, non tutti i PMD sono infettive. I prioni sembrano rappresentare o 'top-performer'fa ampio spettro di aggregati proteici auto-replicanti, che li rende un potente strumento per studiare PMD 8,13.

Curiosamente, la tossicità associata con aggregati correlati alla malattia ha spesso una componente autonoma non cellulare 16,17. Ciò significa che influenzano cellule vicine che non esprimono il gene corrispondente, in contrasto con un effetto strettamente cella autonoma, il che implica che solo le cellule che esprimono il gene mostra il fenotipo specifica. Ciò è stato dimostrato dal convincente espressione tessuto-specifica o abbattere delle rispettive proteine ​​in numerosi modelli di malattie neurodegenerative 18-26. Diversi meccanismi sono stati proposti come base per questo non-tossicità delle cellule autonome in PMD, compresa la fornitura di nutrienti diminuita, squilibrio nella segnalazione neuronale, glutammato, e neuroinfiammazione 16,27,28. Inoltre, un movimento prione-come aggregati malattie legate tra cellule might contribuiscono a questo aspetto 29,30. Una crescente evidenza suggerisce che le inclusioni proteiche diverse da prioni possono trasmettere dalla cella-a-cella, il che può spiegare la caratteristica diffusione della patologia osservata in molti PMD 30-36. Tuttavia, è ancora da stabilire se vi sia un chiaro nesso causale tra movimento intercellulare di proteine ​​di malattia e l'effetto tossico sulle cellule vicine. Pertanto, una migliore comprensione delle vie cellulari che sono alla base della trasmissione cellula-cellula e cellula tossicità non autonoma è necessaria ed essenziale per lo sviluppo di nuove terapie. Tuttavia, molti aspetti della prionica simile diffusione e cellulari fattori che influenzano la trasmissione da cellula a cellula proteine ​​mal ripiegate in metazoi non sono ben compresi, in particolare a livello degli organismi.

Il nematode Caenorhabditis elegans ha diversi vantaggi che forniscono il potenziale per scoprire nuove sfaccettature di prioni come spreading in metazoi 17. È trasparente, consentendo in vivo inseguimento proteine ​​di fluorescenza contrassegnati nell'organismo vivente. Inoltre, molti processi cellulari e fisiologici colpite dalla malattia sono conservati dai vermi per la salute umana, e C. elegans è anche suscettibile di una grande varietà di manipolazioni genetiche e le analisi molecolari e biochimiche 37-39. Esattamente 959 cellule somatiche formano il ermafrodita adulto con un piano di corpo semplice che ha ancora diversi tipi di tessuti diversi, tra cui muscolari, neuroni e intestino.

Per stabilire un nuovo modello di prione in C. elegans, abbiamo scelto di esprimere esogenamente il ben caratterizzato glutammina / asparagina (Q / N) ricchi di prioni NM dominio del citosolico proteina prionica Sup35 lievito, poiché non ci sono noti proteine ​​prioniche endogene in vermi 4,40. Prioni di lievito sono stati inestimabili nel chiarire i meccanismi di base della replicazione prionica 41-44. Inoltre, NM è l'abetest citosolica proteina prionica simile che ha dimostrato di ricapitolare l'intero ciclo di vita di un prione in colture cellulari di mammifero 45,46. Analogamente, quando espresso in C. elegans, il dominio prione Sup35 adottata notevolmente bene alle diverse esigenze di propagazione in cellule metazoi rispetto alle cellule di lievito, caratteristiche principali esposti di prioni biologia aggregazione 40. NM era associato con una profonda fenotipo tossica, compresa la rottura dell'integrità mitocondriale e dell'aspetto vari vescicole autofagia relative a livello cellulare, così come arresto embrionale e larvale, ritardo dello sviluppo, e un disturbo diffusa dell'ambiente ripiegamento proteico a livello organismal. Sorprendentemente, il dominio prione presenta cella cella tossicità autonome autonomo e non, che colpisce i tessuti adiacenti, in cui non è stato espresso il transgene. Inoltre, il trasporto vescicolare del dominio prione all'interno e tra celle è monitorata in tempo reale <em> in vivo 40.

Qui si descrive come esaminare prioni come la diffusione in C. elegans. Spiegheremo come monitorare il trasporto intra e intercellulare di vescicole che contengono il dominio prione con time-lapse microscopia a fluorescenza. Noi sottolineare l'uso di sensori pieghevoli tessuto-specifici e ubiquitariamente espresso ai giornalisti di stress per valutare gli effetti delle cellule cellule autonome autonome e non sul fitness cellulare. Infine, descriveremo la procedura di uno schermo recentemente eseguito genoma ampio RNA interference (RNAi) per identificare nuovi modificatori di tossicità prioni indotta. In combinazione, questi metodi possono aiutare a prendere in giro a parte percorsi genetici coinvolti nel movimento intercellulare delle proteine ​​e la loro non tossicità delle cellule autonome.

Protocol

1. Monitoraggio transcellulare Diffusione delle proteine ​​prioniche come in vivo Time-lapse imaging NOTA: Grow C. elegans wild-type (WT) (N2) e linee transgeniche secondo metodi standard e controllare attentamente la temperatura di coltivazione 47. Generare linee transgeniche di C. elegans esprimere la proteina prionica simile, taggati con proteina monomerica fluorescente rossa (MRFP). Guarda questo video che illustra come utilizzare micr…

Representative Results

Monitoraggio intercellulare diffusione di proteine ​​prioniche come in vivo time-lapse imaging Transgenici C. Linee elegans esprimono il dominio prione sono particolarmente adatti per l'analisi di alcuni aspetti di proteine ​​prioniche come, ad esempio, la trasmissione di cellule-cellula e cellula non tossicità autonomo. La trasparenza degli animali consente il monitoraggio di fluorescente contrassegnati proteine ​​dall&#3…

Discussion

I metodi descritti qui aiutano a illustrare la diffusione e la cella di tossicità autonoma cella complesso autonomo e non di proteine ​​prioniche-like. Abbiamo recentemente scoperto che un dominio citosolico prioni aggregazione incline è ripreso in vescicole di membrana in un processo di autofagia correlato. Un sottoinsieme specifico di queste vescicole trasporta il dominio prione all'interno e tra cellule e tessuti 40. La chiave per monitorare il loro movimento nel animale vivente è che la protein…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Cindy Voisine and Yoko Shibata for helpful discussion and critical comments on the manuscript. We acknowledge the High Throughput Analysis Laboratory (HTAL) and the Biological Imaging Facility (BIF) at Northwestern University for their assistance. This work was funded by grants from the National Institutes of Health (NIGMS, NIA, NINDS), the Ellison Medical Foundation, and the Daniel F. and Ada L. Rice Foundation (to R.I.M.). C.I.N.-K. was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (KR 3726/1-1).

Materials

Reagent
Nanosphere size standards 100 nm ThermoScientific 3100A
Levamisole Sigma L-9756
IPTG Sigma 15502-10G
Ahringer RNAi library Source BioScience LifeSciences  http://www.lifesciences.sourcebioscience
.com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/
Equipment
Sorvall Legend XTR Refrigerated Centrifuge, 120VAC ThermoScientific 75004521 http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_
XTR_Refrigerated_Centrifuge_120
VAC/EW-17707-60
96 pin replicator  Scionomix   http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/
HiGro high-capacity, incubating shaker  Digilab http://www.digilabglobal.com/higro
Multidrop Combi Reagent Dispenser  Titertrek http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm
Biomek FX AP96 Automated Workstation  Beckman Coulter http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm
Innova44 shaker New Brunswick http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec
04&action=products&contentid=1&
catalognode=83389
M205 FA  Leica http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/
ORCA-R2 C10600-10BDigital CCD camera Hamamatsu http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html
Spinning Disc AF Confocal Microscope  Leica http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/
Falcon 4M60 camera  Teledyne Dalsa  http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/
Software
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software Molecular Devices http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html
Hamamatsu SimplePCI Image Analysis Software Meyer Instruments http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm
ImageJ NIH http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
wrMTrck plugin for ImageJ http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html
C. elegans strains
N2 (WT) Caenorhabditis Genetics Center (CGC) http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570
AM815                                                    rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp] Morimoto lab available from our laboratory 
See table 1 for a source for folding sensor and stress reporter strains
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Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans. J. Vis. Exp. (95), e52321, doi:10.3791/52321 (2015).
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