La propagazione di aggregati proteici simile ai prioni è recentemente emersa come implicata in molte malattie neurodegenerative. L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere come utilizzare il nematode C. elegans come sistema modello per monitorare la diffusione delle proteine e per studiare fenomeni simili ai prioni.
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Articolo metodologico
Indagare le proteine prioniche-come diffusione e tossicità di utilizzare i metazoi Organismo modello
In questo articolo
Sommario
Abstract
I prioni sono particelle proteiche autopropaganti non convenzionali, prive di qualsiasi acido nucleico codificante. Questi semi proteici fungono da modelli per la conversione e la replicazione della loro isoforma cellulare benigna. L'accumulo di prove suggerisce che molti aggregati proteici possono agire come modelli autopropaganti e corrompere il ripiegamento delle proteine affini. Sebbene gli aggregati possano essere funzionali in determinate circostanze, questo processo spesso porta all'interruzione dell'omeostasi delle proteine cellulari (proteostasi), portando infine a malattie devastanti come il morbo di Alzheimer (AD), il morbo di Parkinson (PD), la sclerosi laterale amiotrofica (SLA) o le encefalopatie spongiformi trasmissibili (TSE). Gli esatti meccanismi di propagazione dei prioni e di diffusione da cellula a cellula degli aggregati proteici sono ancora oggetto di intense indagini. Per approfondire queste conoscenze, recentemente è stato stabilito un nuovo modello di metazoo in Caenorhabditis elegans, per l'espressione del dominio prionico della proteina prionica di lievito citosolico Sup35. Questo modello di prioni offre diversi vantaggi, in quanto consente il monitoraggio diretto del dominio dei prioni marcati in fluorescenza negli animali viventi e facilita gli approcci genetici. Qui descritti sono i metodi per studiare il comportamento simile ai prioni degli aggregati proteici e per identificare i modificatori della tossicità indotta dai prioni utilizzando C. elegans.
Introduzione
Molte malattie neurodegenerative, tra cui la malattia di Alzheimer (AD), malattia di Parkinson (PD), la sclerosi laterale amiotrofica (SLA), e le encefalopatie spongiformi trasmissibili (TSE), sono associati con le proteine di aggregazione a rischio e sono, quindi, noti collettivamente come misfolding disturbi (PMD ). EST o malattie da prioni costituiscono una classe unica di PMD in che possono essere infettivi in entrambi gli esseri umani e gli animali 1. A livello molecolare, i prioni replicano reclutando e convertendo monomerico α-elica-ricchi PrP cellulari host-codificato (PrP C) nel patologico β-sheet-ricchi PrP Sc conformazion....
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Protocollo
1. Monitoraggio transcellulare Diffusione delle proteine prioniche come in vivo Time-lapse imaging
NOTA: Grow C. elegans wild-type (WT) (N2) e linee transgeniche secondo metodi standard e controllare attentamente la temperatura di coltivazione 47.
- Generare linee transgeniche di C. elegans esprimere la proteina prionica simile, taggati con proteina monomerica fluorescente rossa (MRFP). Guarda questo video che illustra come utilizzare microiniezione 48. Per ulteriori dettagli e metodi che descrivono come integrare queste linee extracromosomici, vedi 49.
- Prepa....
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Risultati
Monitoraggio intercellulare diffusione di proteine prioniche come in vivo time-lapse imaging
Transgenici C. Linee elegans esprimono il dominio prione sono particolarmente adatti per l'analisi di alcuni aspetti di proteine prioniche come, ad esempio, la trasmissione di cellule-cellula e cellula non tossicità autonomo. La trasparenza degli animali consente il monitoraggio di fluorescente contrassegnati proteine dall'interno del.......
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Discussione
I metodi descritti qui aiutano a illustrare la diffusione e la cella di tossicità autonoma cella complesso autonomo e non di proteine prioniche-like. Abbiamo recentemente scoperto che un dominio citosolico prioni aggregazione incline è ripreso in vescicole di membrana in un processo di autofagia correlato. Un sottoinsieme specifico di queste vescicole trasporta il dominio prione all'interno e tra cellule e tessuti 40. La chiave per monitorare il loro movimento nel animale vivente è che la proteina deve .......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo Cindy Voisine e Yoko Shibata per l'utile discussione e i commenti critici sul manoscritto. Ringraziamo l'High Throughput Analysis Laboratory (HTAL) e il Biological Imaging Facility (BIF) della Northwestern University per la loro assistenza. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni del National Institutes of Health (NIGMS, NIA, NINDS), della Ellison Medical Foundation e della Daniel F. e Ada L. Rice Foundation (a R.I.M.). C.I.N.-K. era sostenuta dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (KR 3726/1-1).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagente | |||
| Nanosfere standard di dimensioni 100 nm | ThermoScientific | 3100A | |
| Levamisole | Sigma | L-9756 | |
| IPTG | Sigma | 15502-10G | |
| Ahringer Libreria RNAi | Fonte BioScience LifeSciences | http://www.lifesciences.sourcebioscience .com/prodotti-cloni/non-mammiferi/c-elegans/c-elegans-rnai-library/ | |
| Attrezzatura | |||
| Centrifuga refrigerata Sorvall Legend XTR, 120VAC | ThermoScientific | 75004521 | http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_ XTR_Refrigerated_Centrifuge_120 VAC/EW-17707-60 |
| Replicatore a 96 pin | Scionomix | http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/ | |
| Agitatore di incubazione ad alta capacità HiGro | Digilab | http://www.digilabglobal.com/higro | |
| Dispenser di reagenti combinati multidrop | Titertrek | http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm | |
| Biomek FX AP96 Stazione di lavoro automatizzata | Beckman Coulter | http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm | |
| Innova44 agitatore | New Brunswick | http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec 04& azione=prodotti& contentid=1& catalognode=83389 | |
| M205 FA | Leica | http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/ | |
| ORCA-R2 C10600-10BDittatrice CCD gitale | Hamamatsu | http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html | |
| Spinning Disc AF Confocal Microscope | Leica | http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/ | |
| Fotocamera Falcon 4M60 | Teledyne Dalsa | http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/ | |
| Software | |||
| MetaMorph Microscopy Automation & Software di analisi delle immagini | molecolari | http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html | |
| Hamamatsu SimplePCI Software di analisi delle immagini | Meyer Instruments | http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm | |
| ImageJ | NIH | ||
| http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html il plug-in wrMTrck per ImageJ | http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html | ||
| C. elegans ceppi | |||
| N2 (WT) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570 | |
| AM815 rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp] | Laboratorio | disponibile presso il nostro laboratorio | |
| Vedere la tabella 1 per una fonte di deformazioni |
Riferimenti
- Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
- Jarrett, J. T., Lansbury, P. T. Seeding 'one-dimensional crystallization' of amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer's disease and scrapie.....
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Ristampe e permessi
