طرائق لتقييم السمسة والمناعة من احتراق التبغ الاستعدادات المنتج
Summary
Using optimized human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) ex vivo assays, we showed that a combustible tobacco product preparation markedly suppresses receptor-mediated intracellularly secreted cytokines and cytolytic ability of effector PBMCs. These rapid assays may be useful in product evaluation and understanding the potential long-term effects of tobacco exposure.
Abstract
ومن بين التغييرات الفيزيولوجية المرضية الأخرى، والتعرض المزمن لدخان السجائر يسبب التهاب وقمع المناعي، والتي تم ربطها إلى زيادة التعرض للمدخنين للعدوى الميكروبية وحدوث الأورام. خارج الحي قمع الردود بوساطة مستقبلات المناعة في خلايا الدم وحيدات النوى الطرفية البشرية (PBMCs) تعامل مع مكونات الدخان هو نهج جذابة لدراسة آليات وتقييم الآثار المحتملة على المدى الطويل من التعرض لمنتجات التبغ. هنا، نحن الأمثل طرق لأداء خارج الحي المقايسات باستخدام PBMCs تحفزها lipopolysaccharide في البكتيري، وتول مثل مستقبلات 4 يجند. آثار كله المتوسطة مكيفة الدخان (WS-CM)، وقد تم التحقيق لإعداد منتجات التبغ قابل للاحتراق (TPP)، والنيكوتين على إفراز خلوى وقتل الخلية المستهدفة من قبل PBMCs في المقايسات فيفو السابقين. وتبين لنا أن السيتوكينات يفرز IFN-γ، TNF، IL-10، IL-6، وIL-8 والسيتوكينات داخل الخلايا IFN-قمعت 47 ؛، TNF-α، وMIP-1α في PBMCs WS-CM يتعرض. تم تخفيض وظيفة لحل الخلايا من PBMCs المستجيب، على النحو الذي يحدده مقايسة قتل الخلية المستهدفة K562 أيضا عن التعرض لWS-CM. كان النيكوتين الحد الأدنى من الفعالية في هذه المقايسات. وباختصار، فإننا نقدم مجموعة من تحسين فحوصات لتقييم آثار TPPs في المقايسات فيفو السابقين، وهذه الطرق يمكن تكييفه بسهولة لاختبار المنتجات الأخرى ذات الاهتمام.
Introduction
مجموعة كبيرة من نقاط المعرفة إلى الآثار الصحية السلبية للتدخين السجائر المزمنة، بما في ذلك أمراض القلب والأوعية الدموية، ومرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD) وسرطان 1،2. وقد عرفت تدخين السجائر المزمنة أن تسبب الالتهاب وقمع المناعي، ويتم الإبلاغ عن هذه التعديلات للمساهمة في زيادة خطر العدوى الميكروبية والسرطان لدى المدخنين 3. في المختبر وتقنيات فيفو السابقين مفيدة في توضيح الأساس الجزيئي للآثار المرضية في جسم المريض ل يتم الاعتراف دخان السجائر 4-9 (الجدول 1)، وكأدوات هامة لتوجيه التنظيم الناشئة من منتجات التبغ المختلفة 10،11.
على سبيل المثال، لقد أثبتنا أن الاستعدادات القابلة للاحتراق منتجات التبغ (TPPs) مثل كله المتوسطة مكيفة الدخان (WS-CM) ومجموع الجسيمات (TPM) هي أكثر بكثير السامة للخلايا والضارة لDNA من TPPs غير قابلة للاحتراق أو النيكوتين 12،13. وتمشيا مع الأعمال المنشورة، أفيد مؤخرا أن TPPs قابل للاحتراق أو النيكوتين 12،13. وتمشيا مع الأعمال المنشورة، ونحن ذكرت مؤخرا ان TPPs احتراق تسبب المناعة ملحوظ. ومما يدل على ذلك عن طريق قمع النابعة مثل مستقبلات (TLR) -ligands، حفز إفراز السيتوكينات، واستهدفت خلية (K562) قتل من قبل PBMCs في نموذج خارج الحي 14. ونظرا لأهمية التهاب في السجائر عمليات المرض التي يسببها الدخان، ويرد مزيد من التحسين من الظروف فحص لتقييم الآثار تغييري المناعية للدخان السجائر في هذا التقرير.
وخارج الحي فحوصات قياس عادة داخل الخلايا ويفرز السيتوكينات فضلا عن وظيفة لحل الخلايا السامة للخلايا T والخلايا القاتلة الطبيعية في الخلية K562 مما أسفر عن مقتل 14 المقايسات. المقايسات تضمنت ما قبل الحضانة مع WS-CM والنيكوتين والتحفيز لاحق من PBMCالصورة مع TLR منبهات على مدى 3 أيام؛ يتم تنفيذ قراءات النهائية باستخدام فحوصات انزيم مرتبط المناعي (ELISAs) و / أو التدفق الخلوي. نحن تستخدم lipopolysaccharide في البكتيري (LPS)، والتي تربط لمستقبلات TLR-4 ويحفز PBMCs مما أدى إلى إنتاج السيتوكينات داخل الخلايا وإفراز السيتوكينات. بالإضافة إلى تعظيم الاستفادة من مختلف خطوات الفحص لتقييم الآثار المناعية للTPPs، ونحن أيضا الأساليب الحالية لعزل PBMCs، المقايسات موت الخلايا، وIL-8 الكمي. ويمكن تطبيق هذه الأساليب لمعالجة المسائل البحثية الأخرى ومزيد من الصقل لتقييم منتجات التبغ في سياق تنظيمي.
الجدول 1. نشرت تقارير في المختبر، وبحكم فيفو طرق تستخدم لدراسة varilus الآثار المرضية في جسم المريض من الاستعدادات منتجات التبغ CS، ودخان السجائر المتوسطة؛ CSC، دخان السجائر المكثفات. CSE، والسجائر استخراج الدخان. ELISA، انزيم مرتبط المناعي فحص. GADPH، غليسيرألدهيد نازعة 3-الفوسفات. QPCR، الكمي تفاعل البلمرة المتسلسل. RT، في الوقت الحقيقي البلمرة المتسلسل الكمي التفاعل؛ TS، دخان التبغ.
| المؤلف (سنة الدراسة) | LAAN وآخرون (2004) | مودي وآخرون (2004) | أولتمان وآخرون (2005) | Vayssier (1998) | Witherden وآخرون (2004) | Birrell وآخرون (2008) |
| الخلايا المستخدمة | خلايا البطانة الشعب الهوائية الإنسان (BEAS-2B)، العدلات الإنسان | الخلايا الظهارية السنخية الإنسان (A549) | الهوائية السلس خلايا العضلات الإنسان (HASMC) | خلايا U937 premonocytic الإنسان، وحيدات الإنسان | نوع السنخية II الخلايا الظهارية (ATII) | وحيدي البشريخط الخلية (THP-1)، الضامة رئة الإنسان |
| TPP المستخدمة | CSE | CSC | CSE | TS | CSE | CS |
| الطريقة المستخدمة | ELISA، QPCR، والهجرة، والتحول electromobility | Immunohisto الكيمياء، الكهربي، مجموعة Arrayscan، RT-PCR، ELISA | ELISA، RT-PCR، QPCR، الكهربي | تحول جل التنقل | المجهر الضوئي، المجهر الإلكتروني، الكهربي، ELISA | QPCR، ELISA، طقم-toxate E (سيغما)، لوحة P65 فحص (TransAM)، الكهربي، ومختلف مجموعات المناعية |
| قياس | IL-8، GM-CF، AP-1، NF كيلوبايت، والهجرة | acetyltransferases هيستون، deacetylases هيستون، NF كيلوبايت، IL-8، بي كيلوبايت-α، GADPH | HO-1، GADPH، RANTES، IL-8، eotaxin | حرارة بروتينات الصدمة / الإجهاد (HSP / HSP70)، HF عامل النسخ، NF كيلوبايت،TNF-α | بروتين بالسطح (SP-A، SP-C)، IL-8، MCP-1، GRO-α، TNF-α، IL-1β، IFN-γ | IL-8، IL-1β، IL-6، TNF-α، MIP1-α، GRO-α، MAPK / JNK / ERK الفسفرة، cJUN: الحمض النووي ملزمة، الجلوتاثيون، P65: الحمض النووي ملزمة |
| النتيجة النهائية | CSE أسفل ينظم إنتاج السيتوكينات عبر قمع AP-1 التنشيط. | H 2 O 2 و CSC تعزيز أستلة من البروتينات هيستون، وانخفاض النشاط deacetylase هيستون، تفاضلي تنظيم الإفراج proinflammatory سايتوكاين. | قد يسبب دخان السجائر إطلاق سراح IL-8 من HASMC، تتعزز TNF-α، و 20٪ CSE أقل IL-8 الإفراج عنهم، تثبيط eotaxin وRANTES بدخان السجائر. | TS تنشيط عامل HF النسخ، والذي كان مرتبطا مع HSP70 overexpression وتثبيط NFkB النشاط وإطلاق TNF-α ملزمة. | انخفاض ATII مستويات chemokine المستمدة من خلية وسطا alveoإصلاح لار، والمساهمة في السجائر التي يسببها الدخان ضرر السنخية وانتفاخ الرئة. | توفر البيانات تفسير الآلية لماذا زادت المدخنين التهابات الجهاز التنفسي. ويرافق قمع الاستجابة الفطرية زيادة في IL-8. |
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن وآخرون قد أظهرت في وقت سابق ان علاج PBMCs مع TPPs يقمع عدة ردود، بما في ذلك التعبير وإفراز السيتوكينات وتدابير وظيفية مثل قتل الخلية المستهدفة 14. الطرق التجريبية وصفها في الأعمال السابقة تتطلب فترات حضانة أطول وكانت متواضعة في حجم 14. وبالنظر إلى التطبيقات …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويتم تمويل هذا العمل من قبل RJ شركة التبغ رينولدز (RJRT) بموجب اتفاق البحوث التعاونية مع جامعة ويك فوريست مدرسة الطب. GL براساد هو موظف بدوام كامل من RJRT.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 12 X 75 tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| 2 mL Microtubes | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 3R4F reference cigarettes | Univ. of Kentucky, College of Agriculture | 3R4F | |
| 50 ml conical tubes | Corning | 430828 | |
| 500 ml bottle | Corning | 430282 | |
| 7AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| 96 well flat bottom plate | Termo Nunc | 439454 | |
| 96 well round bottom plates | BD Falcon | 353077 | |
| Cell culture hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 58110R | |
| CFSE | Molecular Probes Life Technologies | C34554 | |
| Cluster tubes | Corning | 4401 | Harmful if swallowed, carcinogen |
| Cytofix/Cytoperm (Permwash) | BD Biosciences | 555028 | Flammable |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide ) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FCAP Array | BD Biosciences | 652099 | Software analyzes CBA data |
| Filter unit | Nalgene | 156-4020 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Canto II | 8 colors, at Ex 405 and Em785. |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Calibur | 4 colors at Ex 495 and Em 785. |
| Flow cytometry analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Freezing Container | Nalgene | 5100-0001 | Contains DMSO, irritant |
| GogliPlug | BD Biosciences | 555029 | Carcinogen, Irritant, Corrosive |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Human Inflammatory Cytokine Kit | BD Biosciences | 551811 | |
| IFN-γ V-500 Antibody | BD Horizon | 561980 | skin sensitizer |
| IL-8 ELISA Kit | R and D Systems | DY208 | |
| Isolation Buffer | Isolymph, CTL Scientific Corp. | 1114868 | Flammable liquid, Irritant |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| L-Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| MIP1-α PE Antibody | BD Pharmingen | 554730 | Acute toxicity, Oral |
| Monensin | Sigma-Aldrich | M5273 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | Acute toxicity, Environmental hazard |
| Parafilm | Bemis | “M” | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Flammable, Skin irritation |
| Pen/strep | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Running buffer | MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech | 130-091-221 | |
| Th1/Th2 CBA Kit | BD Biosciences | 551809 | |
| TNF-α Alexa Fluor 488 Antibody | BioLegend | 502915 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
References
- . . How Tobacco Smoke Causes Disease: The Biology and Behavioral Basis for Smoking-Attributable Disease, A Report of the Surgeon General. , (2010).
- Zeller, M., Hatsukami, D. The Strategic Dialogue on Tobacco Harm Reduction: a vision and blueprint for action in the US. Tob. Control. 18, 324-332 (2009).
- Sopori, M. Effects of cigarette smoke on the immune system. Nature Reviews Immunology. 2, 372-377 (2002).
- Birrell, M. A., Wong, S., Catley, M. C., Belvisi, M. G. Impact of tobacco-smoke on key signaling pathways in the innate immune response in lung macrophages. J. Cell Physiol. 214, 27-37 (2008).
- Laan, M., Bozinovski, S., Anderson, G. P. Cigarette smoke inhibits lipopolysaccharide-induced production of inflammatory cytokines by suppressing the activation of activator protein-1 in bronchial epithelial cells. J. Immunol. 173, 4164-4170 (2004).
- Moodie, F. M., et al. Oxidative stress and cigarette smoke alter chromatin remodeling but differentially regulate NF-kappaB activation and proinflammatory cytokine release in alveolar epithelial cells. Faseb J. 18, 1897-1899 (2004).
- Oltmanns, U., Chung, K. F., Walters, M., John, M., Mitchell, J. A. Cigarette smoke induces IL-8, but inhibits eotaxin and RANTES release from airway smooth muscle. Respir. Res. 6, 74 (2005).
- Vayssier, M., Favatier, F., Pinot, F., Bachelet, M., Polla, B. S. Tobacco smoke induces coordinate activation of HSF and inhibition of NFkappaB in human monocytes: effects on TNFalpha release. Biochem. Biophys. Res. Commun. 252, 249-256 (1998).
- Witherden, I. R., Vanden Bon, E. J., Goldstraw, P., Ratcliffe, C., Pastorino, U., Tetley, T. D. Primary human alveolar type II epithelial cell chemokine release: effects of cigarette smoke and neutrophil elastase. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 30, 500-509 (2004).
- Hatsukami, D. K., Biener, L., Leischow, S. J., Zeller, M. R. Tobacco and nicotine product testing. Nicotine Tob. Res. 14, 7-17 (2012).
- Ashley, D. L., Backinger, C. L., van Bemmel, D. M., Neveleff, D. J. Tobacco Regulatory Science: Research to Inform Regulatory Action at the Food and Drug Administration’s Center for Tobacco Products. Nicotine Tob. Res. , (2014).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Bombick, B., Borgerding, M. F., Prasad, G. L. Evaluation of cytotoxicity of different tobacco product preparations. Regul. Toxicol. Pharmacol. 64, 350-360 (2012).
- Gao, H., Prasad, G. L., Zacharias, W. Differential cell-specific cytotoxic responses of oral cavity cells to tobacco preparations. Toxicol In Vitro. , (2012).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Prasad, G. L. Combustible and non-combustible tobacco product preparations differentially regulate human peripheral blood mononuclear cell functions. Toxicol. In Vitro. 27, 1992-2004 (2013).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research. Cryo Letters. 33, 376-384 (2012).
- Schmid, I., Krall, W. J., Uittenbogaart, C. H., Braun, J., Giorgi, J. V. Dead cell discrimination with 7-amino-actinomycin D in combination with dual color immunofluorescence in single laser flow cytometry. Cytometry. 13, 204-208 (1992).
- Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J. Immunol. Methods. 325, 51-66 (2007).
- Taga, K., Yamauchi, A., Kabashima, K., Bloom, E. T., Muller, J., Tosato, G. Target-induced death by apoptosis in human lymphokine-activated natural killer cells. Blood. 87, 2411-2418 (1996).
