باستخدام فحوصات الخلايا أحادية النواة أحادية النواة للدم المحيطي البشري (PBMC) خارج الجسم الحي ، أظهرنا أن مستحضر منتج التبغ القابل للاحتراق يثبط بشكل ملحوظ السيتوكينات المفرزة داخل الخلايا بوساطة المستقبلات والقدرة المحللة للخلايا ل PBMCs المستجيبة. قد تكون هذه المقايسات السريعة مفيدة في تقييم المنتج وفهم الآثار المحتملة طويلة المدى للتعرض للتبغ.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
طرائق لتقييم السمسة والمناعة من احتراق التبغ الاستعدادات المنتج
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ومن بين التغييرات الفيزيولوجية المرضية الأخرى، والتعرض المزمن لدخان السجائر يسبب التهاب وقمع المناعي، والتي تم ربطها إلى زيادة التعرض للمدخنين للعدوى الميكروبية وحدوث الأورام. خارج الحي قمع الردود بوساطة مستقبلات المناعة في خلايا الدم وحيدات النوى الطرفية البشرية (PBMCs) تعامل مع مكونات الدخان هو نهج جذابة لدراسة آليات وتقييم الآثار المحتملة على المدى الطويل من التعرض لمنتجات التبغ. هنا، نحن الأمثل طرق لأداء خارج الحي المقايسات باستخدام PBMCs تحفزها lipopolysaccharide في البكتيري، وتول مثل مستقبلات 4 يجند. آثار كله المتوسطة مكيفة الدخان (WS-CM)، وقد تم التحقيق لإعداد منتجات التبغ قابل للاحتراق (TPP)، والنيكوتين على إفراز خلوى وقتل الخلية المستهدفة من قبل PBMCs في المقايسات فيفو السابقين. وتبين لنا أن السيتوكينات يفرز IFN-γ، TNF، IL-10، IL-6، وIL-8 والسيتوكينات داخل الخلايا IFN-قمعت 47 ؛، TNF-α، وMIP-1α في PBMCs WS-CM يتعرض. تم تخفيض وظيفة لحل الخلايا من PBMCs المستجيب، على النحو الذي يحدده مقايسة قتل الخلية المستهدفة K562 أيضا عن التعرض لWS-CM. كان النيكوتين الحد الأدنى من الفعالية في هذه المقايسات. وباختصار، فإننا نقدم مجموعة من تحسين فحوصات لتقييم آثار TPPs في المقايسات فيفو السابقين، وهذه الطرق يمكن تكييفه بسهولة لاختبار المنتجات الأخرى ذات الاهتمام.
المقدمة
مجموعة كبيرة من نقاط المعرفة إلى الآثار الصحية السلبية للتدخين السجائر المزمنة، بما في ذلك أمراض القلب والأوعية الدموية، ومرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD) وسرطان 1،2. وقد عرفت تدخين السجائر المزمنة أن تسبب الالتهاب وقمع المناعي، ويتم الإبلاغ عن هذه التعديلات للمساهمة في زيادة خطر العدوى الميكروبية والسرطان لدى المدخنين 3. في المختبر وتقنيات فيفو السابقين مفيدة في توضيح الأساس الجزيئي للآثار المرضية في جسم المريض ل يتم الاعتراف دخان السجائر 4-9 (الجدول 1)، وكأدوات هامة لتوجيه التنظيم الناشئة من منتجات التبغ المختلفة 10،11.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم الحصول على موافقة خطية مطلعة أن تفعل هذه الدراسة في وحدة الأبحاث السريرية المحلية في ظل موافقة IRB، في الممارسات السريرية الجيدة: ملاحظة. تجهيز الدم، يتم تنفيذ عزل PBMCs وغيرها من تجارب زراعة الخلايا تحت ظروف معقمة، وذلك باستخدام إمدادات معقمة الميكروبيولوجية والكواشف.
1. WS-CM إعداد
- توليد WS-CM كما هو موضح سابقا (12).
- إعداد WS-CM عن طريق تمرير الدخان من أربعة 3R4F السج....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وعرضت النتائج على النحو يعني الخطأ ± المعياري للمتوسط (أربع عينات المانحة). تم إجراء اختبار t الطالب بين عينات مراقبة المعالجة وغير المعالجة باستخدام برنامج إكسل وكذلك مقارنات اختبار t لجميع العلاجات مع الضوابط المقابلة الخاصة بهم. وأشار إلى الأهمية الإحصائية عن طريق: *، P <0.05. **، P <0.005. ***، P <0.0005.
لقياس تأثير التعرض لWS-CM والنيكوتين، تم علاج PBMCs مع تركيزات مختلفة من WS-CM والنيكوتين لمدة.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
نحن وآخرون قد أظهرت في وقت سابق ان علاج PBMCs مع TPPs يقمع عدة ردود، بما في ذلك التعبير وإفراز السيتوكينات وتدابير وظيفية مثل قتل الخلية المستهدفة 14. الطرق التجريبية وصفها في الأعمال السابقة تتطلب فترات حضانة أطول وكانت متواضعة في حجم 14. وبالنظر إلى التطبيقات المحتملة لهذا النموذج جذابا خارج الحي لالبحوث الأساسية والتطبيقية، ونحن التحقيق ما إذا كان أي من المعلمات مقايسة في هذه المقايسات البيولوجية متعددة الخطوات يمكن أن يكون الأمثل. هنا، نقدم مبسطة.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه لا يوجد تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
ويتم تمويل هذا العمل من قبل RJ شركة التبغ رينولدز (RJRT) بموجب اتفاق البحوث التعاونية مع جامعة ويك فوريست مدرسة الطب. GL براساد هو موظف بدوام كامل من RJRT.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أنابيب 12 × 75 مم | BD | Falcon 352058 | |
| 15 مل أنابيب مخروطية Corning | 430790 | ||
| 2 مل أنابيب دقيقة | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 3R4F السجائر المرجعية | جامعة كنتاكي ، كلية الزراعة | 3R4F | |
| 50 مل أنابيب مخروطية | كورنينج | 430828 | |
| 500 مل | كورنينج | 430282 | |
| 7AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| لوحة سفلية مسطحة 96 بئر | Termo Nunc | 439454 | |
| ألواح سفلية مستديرة 96 بئر BD | Falcon | 353077 | |
| غطاء ثقافة الخلية | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| طرد مركزي | Eppendorf | 58110R | |
| CFSE | المجسات الجزيئية تقنيات الحياة | C34554 | |
| العنقودية | Corning | 4401 | ضارة في حالة الابتلاع ، مادة مسرطنة |
| Cytofix / Cytoperm (Permwash) | BD Biosciences | 555028 | قابل للاشتعال |
| (ثنائي ميثيل سلفوكسيد) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| FBS | Sigma-Aldrich | يحلل برنامج F2442 | |
| FCAP Array | BD Biosciences | 652099 | تصفية بيانات CBA |
| Nalgene | 156-4020 | ||
| مقياس التدفق الخلوي | BD Biosciences | FACS Canto II | 8 ألوان ، في Ex 405 و Em 785. |
| مقياس التدفق الخلوي | BD Biosciences | FACS Calibur | 4 ألوان في Ex 495 و Em 785. |
| يحتوي برنامج تحليل قياس التدفق | Tree Star | FlowJo | |
| التجميد | Nalgene | 5100-0001 | على DMSO ، مهيج |
| GogliPlug | BD Biosciences | 555029 | مادة مسرطنة ، مهيجة ، أكالة |
| H2< / sub>SO4< / sub> | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| مجموعة | السيتوكين الالتهابية البشريةBD Biosciences | 551811 | |
| IFN-& gamma; V-500 الأجسام المضادة | BD Horizon | 561980 | محسس الجلد |
| IL-8 ELISA Kit | R and D Systems | DY208 | |
| عازلة العزل | Isolymph ، CTL Scientific Corp. | 1114868 | سائل قابل للاشتعال ، مهيج |
| كحول الأيزوبروبيل | سيجما ألدريتش | W292907 | |
| L-Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| MIP1- & alpha ؛ PE الأجسام المضادة | BD Pharmingen | 554730 | السمية الحادة ، عن طريق الفم |
| Monensin | Sigma-Aldrich | M5273 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| النيكوتين | سيجما-ألدريتش | N3876 | السمية الحادة ، المخاطر البيئية |
| Parafilm | Bemis | " م" | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | قابل للاشتعال ، تهيج الجلد |
| قلم / بكتيريا | عقدية Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| تشغيل عازلة | MACS Running Buffer ، Miltenyi Biotech | 130-091-221 | |
| Th1 / Th2 CBA Kit | BD Biosciences | 551809 | |
| TNF- & ألفا; Alexa Fluor 488 الأجسام المضادة | BioLegend | 502915 | |
| نقل الماصة | فيشر Scientific | 13-711-20 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
المراجع
- How Tobacco Smoke Causes Disease: The Biology and Behavioral Basis for Smoking-Attributable Disease, A Report of the Surgeon General. , U.S. Department of Health and Human Services. (2010).
- Zeller, M., Hatsukami, D. The Strategic Dialogu....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
