Métodos para avaliar a citotoxicidade e Imunossupressão de combustível tabaco Preparações Produto
Summary
Using optimized human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) ex vivo assays, we showed that a combustible tobacco product preparation markedly suppresses receptor-mediated intracellularly secreted cytokines and cytolytic ability of effector PBMCs. These rapid assays may be useful in product evaluation and understanding the potential long-term effects of tobacco exposure.
Abstract
Entre outras alterações fisiopatológicas, a exposição crónica ao fumo do cigarro provoca a inflamação e a supressão imunitária, que têm sido associados ao aumento da susceptibilidade dos fumadores a infecções microbianas e a incidência de tumores. Ex vivo supressão de respostas imunes mediadas por receptores em células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC) tratadas com constituintes do fumo é uma abordagem atraente para estudar os mecanismos e avaliar os possíveis efeitos a longo prazo da exposição a produtos do tabaco. Aqui, nós optimizado métodos para realizar ensaios ex vivo utilizando PBMC estimuladas por lipopolissacarídeo bacteriano, um receptor-ligando 4 de tipo Toll. Os efeitos do meio condicionado de fumo todo (WS-CM), a preparação de produtos de tabaco combustível (TPP), e nicotina foram investigados sobre a secreção de citocinas e alvo morte celular por PBMC nos ensaios ex vivo. Mostramos que as citocinas secretadas IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6, e IL-8 e citocinas intracelulares IFN-47 ;, o TNF-α, e MIP-1α foram suprimidos em PBMC WS-CM-expostos. A função citolítica de PBMC efectoras, conforme determinado por um ensaio de matar células K562 alvo também foi reduzida por exposição a WS-CM; nicotina era minimamente eficaz nestes ensaios. Em resumo, é apresentado um conjunto de ensaios melhorados para avaliar os efeitos de UTEs em ensaios ex vivo, e estes métodos podem ser facilmente adaptados para testar outros produtos de interesse.
Introduction
Um corpo substancial de pontos de conhecimento para os efeitos adversos para a saúde de tabagismo crônico, incluindo a doença cardiovascular (DCV), doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) e câncer de 1,2. Fumar do cigarro crónica tem sido conhecido por causar inflamação e supressão imune, e estas alterações estão relatados para contribuir para o aumento do risco de infecção microbiana e o cancro em fumadores 3. Estudos in vitro e ex vivo, as técnicas são úteis para elucidar a base molecular dos efeitos patofisiológicos de fumaça de cigarro 4-9 (Tabela 1) e são reconhecidos como importantes ferramentas para orientar a regulamentação emergente de vários produtos do tabaco 10,11.
Por exemplo, nós demonstramos que inflamáveis produtos do tabaco (UTEs), como meio de toda com ar-fumo (WS-CM) e material particulado total (TPM) são muito mais citotóxica e prejudicial paraDNA de UTEs não-combustíveis ou nicotina 12,13. Consistente com o trabalho publicado, foi recentemente informou que UTEs combustíveis ou nicotina 12,13. Consistente com o trabalho publicado, que recentemente informou que UTEs combustíveis causou acentuada imunodepressão. Isto foi demonstrado pela supressão da Toll- como receptores (TLR) -ligands, estimulou a secreção de citocinas, e célula-alvo (K562) matando por PBMC em um modelo ex vivo 14. Dada a importância da inflamação em processos de doença induzida por fumo de cigarro, uma maior optimização das condições de ensaio para avaliar os efeitos imunomoduladores do fumo do cigarro é apresentado no presente relatório.
Os ensaios ex vivo tipicamente medido intracelular e citocinas, bem como a função citolítica das células T citotóxicas e de células K562 NK em ensaios de morte 14 segregada. Os ensaios envolvidos pré-incubação com WS-CM e nicotina e subsequente estimulação de PBMCs com agonistas de TLR durante um período de 3 dias; as leituras finais são realizadas utilizando ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA) e / ou citometria de fluxo. Utilizamos o lipopolissacarídeo bacteriano (LPS), que se liga a receptores TLR-4 e estimula as CMSPs resultando na produção de citocinas intracelulares e de secreção de citocinas. Além disso a optimização das diversas etapas do ensaio para avaliação dos efeitos imunomoduladores da UTEs, também presentes métodos para isolar as PBMC, ensaios de morte celular, e a quantificação de IL-8. Estes métodos podem ser aplicados para abordar outras questões de pesquisa e mais refinado para avaliar os produtos do tabaco no contexto regulamentar.
Tabela 1. relatos de in vitro e ex vivo Publicado métodos usados para estudar varilus efeitos fisiopatológicos de preparações de produtos de tabaco CS, médio fumaça de cigarro.; CSC, fumaça de cigarro condensado; CSE, cigarro extrato de fumo; ELISA, enzima-linked immunosorbent assay; GADPH, gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase; qPCR, a reação em cadeia da polimerase quantitativa; RT, em tempo real reação em cadeia da polimerase quantitativa; TS, fumo de tabaco.
| Autor (ano de estudo) | Laan et al. (2004) | Moodie et al. (2004) | Oltmanns et al. (2005) | Vayssier (1998) | Witherden et al. (2004) | Birrell, et al. (2008) |
| As células usadas | Células do endotélio brônquicas humanas (BEAS-2B), neutrófilos humanos | Células epiteliais alveolares Humanos (A549) | Vias aéreas células musculares lisas Humanos (HASMC) | As células U937 premonocytic Humanos, monócitos humanos | Alveolares tipo II células epiteliais (ATII) | Monocytic HumanoA linha de células (células THP-1), os macrófagos de pulmão humano |
| TPP usado | CSE | CSC | CSE | TS | CSE | CS |
| Método usado | ELISA, qPCR, migração, mudança electromobility | Imuno-química, electroforese, kit Arrayscan, RT-PCR, ELISA | ELISA, RT-PCR, qPCR, electroforese | Mudança Gel-mobilidade | A microscopia óptica, microscopia eletrônica, eletroforese, ELISA | qPCR, ELISA, kit de E-toxate (Sigma), o ensaio de placa de p65 (TransAM), electroforese, vários kits de imunoensaio |
| Medida | IL-8, GM-CF, AP-1, NF-kB, a migração | Acetiltransferases de histona, desacetilases de histonas, NF-kB, IL-8, pi-kB α, GADPH | HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, eotaxina | Proteínas de choque térmico / estresse (HSP / Hsp70), fator de transcrição HF, NF-kB,TNF-α | Proteína tensioactiva (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, o TNF-α, IL-1β, IFN-γ | IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α, MAPK / JNK / fosforilação de ERK, cJun: ligação de ADN, a glutationa, o p65: ligação de ADN |
| Resultado final | CSE regula negativamente a produção de citocinas por meio de supressão da activação de AP-1. | H 2 O 2 e CSC melhorar a acetilação de proteínas histona, diminuir a actividade de histona-desacetilase, diferencialmente regulam a libertação de citocina pró-inflamatória. | A fumaça do cigarro pode causar a liberação de IL-8 de HASMC, reforçada por TNF-α, 20% CSE menos IL-8 libertação, a inibição da eotaxina e RANTES por fumaça de cigarro. | TS activado fator de transcrição HF, que foi associado com Hsp70 superexpressão e inibição da actividade NFkB e TNF-α liberação vinculativo. | Redução ATII níveis de quimiocinas derivadas de células compromisso alveoreparação lar, contribuindo para o cigarro induzida pelo fumo dano alveolar e enfisema. | Dados fornecer explicação mecanicista para infecções respiratórias por que os fumantes têm aumentado. Supressão da resposta inata é acompanhada por um aumento na produção de IL-8. |
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós e outros autores demonstraram previamente que o tratamento das PBMC com UTEs suprime a várias respostas, incluindo a expressão e a secreção de citocinas e medidas funcionais, tais como células alvo de matar 14. Os métodos experimentais descritos na obra anterior exigem períodos de incubação mais longos e eram modestas em magnitude 14. Dadas as potenciais aplicações desse modelo atrativo ex vivo para pesquisa básica e aplicada, investigamos se algum dos parâmetros do ensai…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é financiado pela RJ Reynolds Tobacco Company (RJRT) sob um contrato de investigação em colaboração com a Escola Wake Forest University of Medicine. GL Prasad é um funcionário em tempo integral da RJRT.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 12 X 75 tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| 2 mL Microtubes | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 3R4F reference cigarettes | Univ. of Kentucky, College of Agriculture | 3R4F | |
| 50 ml conical tubes | Corning | 430828 | |
| 500 ml bottle | Corning | 430282 | |
| 7AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| 96 well flat bottom plate | Termo Nunc | 439454 | |
| 96 well round bottom plates | BD Falcon | 353077 | |
| Cell culture hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 58110R | |
| CFSE | Molecular Probes Life Technologies | C34554 | |
| Cluster tubes | Corning | 4401 | Harmful if swallowed, carcinogen |
| Cytofix/Cytoperm (Permwash) | BD Biosciences | 555028 | Flammable |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide ) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FCAP Array | BD Biosciences | 652099 | Software analyzes CBA data |
| Filter unit | Nalgene | 156-4020 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Canto II | 8 colors, at Ex 405 and Em785. |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Calibur | 4 colors at Ex 495 and Em 785. |
| Flow cytometry analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Freezing Container | Nalgene | 5100-0001 | Contains DMSO, irritant |
| GogliPlug | BD Biosciences | 555029 | Carcinogen, Irritant, Corrosive |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Human Inflammatory Cytokine Kit | BD Biosciences | 551811 | |
| IFN-γ V-500 Antibody | BD Horizon | 561980 | skin sensitizer |
| IL-8 ELISA Kit | R and D Systems | DY208 | |
| Isolation Buffer | Isolymph, CTL Scientific Corp. | 1114868 | Flammable liquid, Irritant |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| L-Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| MIP1-α PE Antibody | BD Pharmingen | 554730 | Acute toxicity, Oral |
| Monensin | Sigma-Aldrich | M5273 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | Acute toxicity, Environmental hazard |
| Parafilm | Bemis | “M” | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Flammable, Skin irritation |
| Pen/strep | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Running buffer | MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech | 130-091-221 | |
| Th1/Th2 CBA Kit | BD Biosciences | 551809 | |
| TNF-α Alexa Fluor 488 Antibody | BioLegend | 502915 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
References
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