שיטות להערכת Cytotoxicity ודיכוי חיסוני של תכשירי מוצרים דליקים טבק
Summary
Using optimized human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) ex vivo assays, we showed that a combustible tobacco product preparation markedly suppresses receptor-mediated intracellularly secreted cytokines and cytolytic ability of effector PBMCs. These rapid assays may be useful in product evaluation and understanding the potential long-term effects of tobacco exposure.
Abstract
בין שינויי pathophysiological אחרים, חשיפה כרונית לעשן סיגריות גורמת לדלקת ודיכוי מערכת חיסונית, אשר נקשר לרגישות מוגברת של מעשנים לזיהומי חיידקים ושכיחות גידולים. Ex vivo דיכוי של מערכת חיסונית בתיווך קולט בתאי הדם היקפיים mononuclear אנושיים (PBMCs) טופל במרכיבי עשן הוא גישה אטרקטיבית ללמוד מנגנונים ולהעריך את ההשפעות ארוכת הטווח הסבירה של חשיפה למוצרי טבק. כאן, אנו מותאמים שיטות לבצע מבחני vivo לשעבר באמצעות PBMCs מגורה על ידי lipopolysaccharide חיידקים, יגנד רצפטור-4-כמו אגרה. ההשפעות של מדיום כל ממוזג עשן (WS-CM), הכנת מוצר טבק דליק (TPP), וניקוטין נחקרו על הפרשת ציטוקינים והרג תאי מטרה על ידי PBMCs במבחני vivo לשעבר. אנו מראים כי ציטוקינים מופרשים IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6, IL-8 וציטוקינים תאיים IFN-47 ;, TNF-α, וMIP-1α דוכאו בPBMCs החשופה-WS-CM. פונקצית cytolytic של PBMCs מפעיל, כפי שנקבעו על ידי assay תא מטרת K562 הורג גם מופחתת על ידי חשיפה לWS-CM; הניקוטין היה מינימאלי יעיל במבחנים אלה. לסיכום, אנו מציגים סדרה של מבחני השתפרו להעריך את ההשפעות של עקר במבחני vivo לשעבר, ושיטות אלה יכולים להתאים בקלות לבדיקת מוצרים אחרים בעלי עניין.
Introduction
גוף משמעותי של נקודות ידע לתופעות לוואי הבריאותיות של עישון סיגריה כרוני, כולל מחלות לב וכלי דם (CVD), מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) וסרטן 1,2. עישון סיגריות כרוני כבר ידוע לגרום לדלקת ודיכוי מערכת חיסונית, ושינויים אלה דיווחו לתרום לעלייה בסיכון לזיהום חיידקים וסרטן במעשנים 3. במבחנה וטכניקות vivo לשעבר שימושיות בהבהרת הבסיס המולקולרי של תופעות pathophysiological של עשן סיגריות 4-9 (טבלת 1) ומוכרות ככלים חשובים להדרכת תקנה החדשה של מוצרי טבק שונים 10,11.
לדוגמא, יש לנו הפגנו כי הכנות דליקים מוצר טבק (בעקר) כגון בינוני כל-מותנה עשן (WS-CM) וחומר חלקיקים כולל (TPM) הן הרבה יותר רעילות לתאים ומזיק לDNA מאשר בעקר או ניקוטין 12,13 אינו דליקים. עולה בקנה אחד עם העבודה שפורסמה, היא דיווחה לאחרונה כי בעקר או ניקוטין 12,13 דליקים. עולה בקנה אחד עם העבודה שפורסמה, שדיווחנו לאחרונה כי בעקר דליק גרם דיכוי חיסוני משמעותי. זה מעיד דיכוי Toll- כמו קולט -ligands (TLR), מגורה הפרשת ציטוקינים, וממוקד תא (K562) ההמתה בPBMCs במודל vivo לשעבר 14. בהתחשב במשמעות של דלקת בתהליכי מחלה נגרמים על-עשן סיגריות, אופטימיזציה נוספת של תנאי assay כדי להעריך את השפעות modulatory חיסון של עשן סיגריות מוצגת בדוח זה.
Vivo לשעבר מבחני בדרך כלל נמדדים תוך-תאיים ומופרשים ציטוקינים כמו גם הפונקציה של cytolytic ציטוטוקסיות תאי T וNK בתא K562 הורגת מבחני 14. מבחני מעורבים מראש דגירה עם WS-CM וניקוטין והגירוי הבא של PBMCים עם TLR אגוניסטים על פני תקופה של 3 ימים; הקריאות הסופיות מבוצעות באמצעות מבחני צמודי אנזים immunosorbent (ELISAs) ו / או cytometry זרימה. אנו מנוצלים lipopolysaccharide חיידקים (LPS), אשר נקשר לקולטנים TLR-4 ומעורר PBMCs כתוצאה מכך הייצור של ציטוקינים והפרשה של ציטוקינים תאיים. בנוסף לאופטימיזציה של צעדי assay השונים להערכת השפעות המערכת החיסונית של עקר, אנחנו גם שיטות הנוכחיות לPBMCs בידוד, מבחני מוות של תאים, ו- IL-8 כימות. שיטות אלה עשויות להיות מיושמות מטרה לענות על שאלות מחקר אחרות ומעודנות יותר כדי להעריך מוצרי טבק בהקשר הרגולטורי.
טבלת 1. פורסם דיווחים על במבחנה ושיטות לשעבר vivo משמשות ללמוד אפקטי pathophysiological varilus של הכנות מוצר טבק CS, בינוני עשן סיגריות.; CSC, עיבוי עשן סיגריות; מנוע חיפוש מותאם אישית, תמצית עשן סיגריות; ELISA, אנזים צמוד immunosorbent assay; GADPH, glyceraldehyde dehydrogenase 3-פוספט; qPCR, תגובת שרשרת של פולימראז כמותיים; RT, תגובת השרשרת של פולימראז כמותיים זמן אמת; TS, עשן טבק.
| מחבר (שנת הלימוד) | אל Laan et. (2004) | אל מודי et. (2004) | אל Oltmanns et. (2005) | Vayssier (1998) | אל Witherden et. (2004) | אל Birrell et. (2008) |
| תאים המשמשים | תאים אנושיים הסימפונות האנדותל (BEAS-2B), נויטרופילים אדם | תאים אנושיים alveolar אפיתל (A549) | תאי שריר חלקים בדרכי נשימה אנושיות (HASMC) | תאים אנושיים premonocytic U937, מונוציטים אדם | סוג מכתשי II תאי אפיתל (ATII) | monocytic אדםשורת תאים (THP-1), מקרופאגים ריאות אנושיים |
| TPP משמש | מנוע חיפוש מותאם אישית | CSC | מנוע חיפוש מותאם אישית | TS | מנוע חיפוש מותאם אישית | CS |
| שיטה | ELISA, qPCR, הגירה, שינוי electromobility | Immunohisto-כימיה, אלקטרופורזה, ערכת Arrayscan, RT-PCR, ELISA | ELISA, RT-PCR, qPCR, אלקטרופורזה | משמרת ג'ל ניידות | מיקרוסקופ אור, מיקרוסקופ אלקטרונים, אלקטרופורזה, ELISA | qPCR, ELISA, ערכת E-toxate (Sigma), assay צלחת p65 (TransAM), אלקטרופורזה, ערכות immunoassay שונות |
| מדד | IL-8, GM-CF, AP-1, NF-κB, הגירה | acetyltransferases היסטון, deacetylases היסטון, NF-κB, IL-8, PI κB-α, GADPH | HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, eotaxin | חלבוני הלם / עומס חום (HSP / Hsp70), גורם שעתוק HF, NF-κB,TNF-α | חלבון פעילי שטח (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, TNF-α, IL-1β, IFN-γ | IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α, MAPK / JNK / זירחון ERK, cJUN: DNA מחייב, גלוטתיון, p65: DNA מחייב |
| תוצאה סופית | מנוע חיפוש מותאם אישית מטה-מווסת את ייצור ציטוקינים באמצעות דיכוי ההפעלה AP-1. | H 2 O 2 וCSC לשפר acetylation של חלבוני היסטון, להקטין פעילות deacetylase היסטון, באופן דיפרנציאלי להסדיר שחרור ציטוקינים מעודדי דלקת. | עשן סיגריות עלול לגרום לשחרורו של IL-8 מHASMC, משופר על ידי TNF-α, CSE 20% פחות שחרור IL-8, עיכוב של eotaxin וטווחים על ידי עשן סיגריות. | TS הופעל גורם שעתוק HF, שהיה קשור עם ביטוי יתר Hsp70 ועיכוב של NFkB מחייב פעילות ושחרור TNF-α. | alveo רמות chemokine תאים שמקורם ATII מופחת פשרהתיקון lar, תורם לנזק סיגריה מושרה עשן alveolar ואמפיזמה. | נתונים לספק הסבר מכניסטי לזיהומים בדרכי הנשימה מדוע מעשנים גדלו. דיכוי התגובה המולדת מלווה בעלייה בIL-8. |
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו ואחרים הוכיחו בעבר כי הטיפול בPBMCs עם עקר מדכא כמה תגובות, כוללים ביטוי והפרשה של ציטוקינים ופעולות פונקציונליות כגון תא המטרה להרוג 14. השיטות הניסיוניות שתוארו בעבודה הקודמת דורשות תקופות דגירה ארוכות יותר והיו צנועים בגודל 14. בהתחשב ביישומים הפוטנצ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו ממומנת על ידי RJ Reynolds חברת הטבק (RJRT) במסגרת הסכם לשיתוף פעולה מחקרית עם בית הספר לאוניברסיטת Wake Forest לרפואה. GL פראסאד הוא עובד במשרה מלאה של RJRT.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 12 X 75 tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| 2 mL Microtubes | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 3R4F reference cigarettes | Univ. of Kentucky, College of Agriculture | 3R4F | |
| 50 ml conical tubes | Corning | 430828 | |
| 500 ml bottle | Corning | 430282 | |
| 7AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| 96 well flat bottom plate | Termo Nunc | 439454 | |
| 96 well round bottom plates | BD Falcon | 353077 | |
| Cell culture hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 58110R | |
| CFSE | Molecular Probes Life Technologies | C34554 | |
| Cluster tubes | Corning | 4401 | Harmful if swallowed, carcinogen |
| Cytofix/Cytoperm (Permwash) | BD Biosciences | 555028 | Flammable |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide ) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FCAP Array | BD Biosciences | 652099 | Software analyzes CBA data |
| Filter unit | Nalgene | 156-4020 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Canto II | 8 colors, at Ex 405 and Em785. |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Calibur | 4 colors at Ex 495 and Em 785. |
| Flow cytometry analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Freezing Container | Nalgene | 5100-0001 | Contains DMSO, irritant |
| GogliPlug | BD Biosciences | 555029 | Carcinogen, Irritant, Corrosive |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Human Inflammatory Cytokine Kit | BD Biosciences | 551811 | |
| IFN-γ V-500 Antibody | BD Horizon | 561980 | skin sensitizer |
| IL-8 ELISA Kit | R and D Systems | DY208 | |
| Isolation Buffer | Isolymph, CTL Scientific Corp. | 1114868 | Flammable liquid, Irritant |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| L-Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| MIP1-α PE Antibody | BD Pharmingen | 554730 | Acute toxicity, Oral |
| Monensin | Sigma-Aldrich | M5273 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | Acute toxicity, Environmental hazard |
| Parafilm | Bemis | “M” | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Flammable, Skin irritation |
| Pen/strep | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Running buffer | MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech | 130-091-221 | |
| Th1/Th2 CBA Kit | BD Biosciences | 551809 | |
| TNF-α Alexa Fluor 488 Antibody | BioLegend | 502915 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
References
- . . How Tobacco Smoke Causes Disease: The Biology and Behavioral Basis for Smoking-Attributable Disease, A Report of the Surgeon General. , (2010).
- Zeller, M., Hatsukami, D. The Strategic Dialogue on Tobacco Harm Reduction: a vision and blueprint for action in the US. Tob. Control. 18, 324-332 (2009).
- Sopori, M. Effects of cigarette smoke on the immune system. Nature Reviews Immunology. 2, 372-377 (2002).
- Birrell, M. A., Wong, S., Catley, M. C., Belvisi, M. G. Impact of tobacco-smoke on key signaling pathways in the innate immune response in lung macrophages. J. Cell Physiol. 214, 27-37 (2008).
- Laan, M., Bozinovski, S., Anderson, G. P. Cigarette smoke inhibits lipopolysaccharide-induced production of inflammatory cytokines by suppressing the activation of activator protein-1 in bronchial epithelial cells. J. Immunol. 173, 4164-4170 (2004).
- Moodie, F. M., et al. Oxidative stress and cigarette smoke alter chromatin remodeling but differentially regulate NF-kappaB activation and proinflammatory cytokine release in alveolar epithelial cells. Faseb J. 18, 1897-1899 (2004).
- Oltmanns, U., Chung, K. F., Walters, M., John, M., Mitchell, J. A. Cigarette smoke induces IL-8, but inhibits eotaxin and RANTES release from airway smooth muscle. Respir. Res. 6, 74 (2005).
- Vayssier, M., Favatier, F., Pinot, F., Bachelet, M., Polla, B. S. Tobacco smoke induces coordinate activation of HSF and inhibition of NFkappaB in human monocytes: effects on TNFalpha release. Biochem. Biophys. Res. Commun. 252, 249-256 (1998).
- Witherden, I. R., Vanden Bon, E. J., Goldstraw, P., Ratcliffe, C., Pastorino, U., Tetley, T. D. Primary human alveolar type II epithelial cell chemokine release: effects of cigarette smoke and neutrophil elastase. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 30, 500-509 (2004).
- Hatsukami, D. K., Biener, L., Leischow, S. J., Zeller, M. R. Tobacco and nicotine product testing. Nicotine Tob. Res. 14, 7-17 (2012).
- Ashley, D. L., Backinger, C. L., van Bemmel, D. M., Neveleff, D. J. Tobacco Regulatory Science: Research to Inform Regulatory Action at the Food and Drug Administration’s Center for Tobacco Products. Nicotine Tob. Res. , (2014).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Bombick, B., Borgerding, M. F., Prasad, G. L. Evaluation of cytotoxicity of different tobacco product preparations. Regul. Toxicol. Pharmacol. 64, 350-360 (2012).
- Gao, H., Prasad, G. L., Zacharias, W. Differential cell-specific cytotoxic responses of oral cavity cells to tobacco preparations. Toxicol In Vitro. , (2012).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Prasad, G. L. Combustible and non-combustible tobacco product preparations differentially regulate human peripheral blood mononuclear cell functions. Toxicol. In Vitro. 27, 1992-2004 (2013).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research. Cryo Letters. 33, 376-384 (2012).
- Schmid, I., Krall, W. J., Uittenbogaart, C. H., Braun, J., Giorgi, J. V. Dead cell discrimination with 7-amino-actinomycin D in combination with dual color immunofluorescence in single laser flow cytometry. Cytometry. 13, 204-208 (1992).
- Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J. Immunol. Methods. 325, 51-66 (2007).
- Taga, K., Yamauchi, A., Kabashima, K., Bloom, E. T., Muller, J., Tosato, G. Target-induced death by apoptosis in human lymphokine-activated natural killer cells. Blood. 87, 2411-2418 (1996).
