方法评估细胞毒性的可燃烟草产品的准备和免疫抑制
Summary
Using optimized human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) ex vivo assays, we showed that a combustible tobacco product preparation markedly suppresses receptor-mediated intracellularly secreted cytokines and cytolytic ability of effector PBMCs. These rapid assays may be useful in product evaluation and understanding the potential long-term effects of tobacco exposure.
Abstract
除其他病理生理改变，长期暴露于香烟烟雾导致炎症和免疫抑制，它已与吸烟者微生物感染和肿瘤发生率的增加的易感性。 体外抑制人外周血单核细胞中的受体介导的免疫应答（PBMCs）中与烟气成分处理是研究的机制和评估暴露于烟草制品的可能的长期影响的有吸引力的方法。在这里，我们的优化方法来执行体外使用的PBMC通过细菌脂多糖，Toll样受体4配体刺激的测定。整体烟条件培养基（WS-CM）的影响，可燃烟草制品的制备（TPP），和尼古丁通过在体外测定法的PBMC研究对细胞因子分泌和靶细胞杀伤。我们表明，分泌的细胞因子IFN-γ，TNF，IL-10，IL-6和IL-8和细胞内细胞因子IFN-47 ;, TNF-α和MIP-1α被压制在WS-CM-暴露的PBMC。效应器的PBMC的细胞毒性作用，如通过对K562靶细胞的杀伤测定法测定也减少通过暴露于WS-CM;尼古丁是效果最差的，这些检测。总之，我们提出了一组改进的测定法来评估的TPP的在体外测定法的影响，并且这些方法可容易地适用于测试其他感兴趣的产品。
Introduction
知识点大幅身体的慢性吸烟的健康的不利影响，包括心血管疾病（CVD），慢性阻塞性肺疾病（COPD）和癌症1,2。慢性吸烟已经知道，引起炎症和免疫抑制，并且这些改变被报告给有助于微生物感染和癌症中的吸烟者3的危险性增加。 在体外和离体技术是有用在阐明的病理生理作用的分子基础香烟烟雾4-9（ 表1）和被认为是用于引导各种烟草制品10,11新兴调控的重要工具。
例如，我们已经表明，可燃烟草产品制剂（的TPP）如全烟雾条件培养基（WS-CM）和总颗粒物质（TPM）远远更多的细胞毒性和损害DNA比非易燃的TPP或尼古丁12,13。一贯以发表的作品，这是最近报道，可燃的TPP或尼古丁12,13。一贯以发表的作品，我们最近报道说，可燃的TPP造成显着的免疫抑制。这是证明了抑制长话样受体（TLR）-ligands，刺激细胞因子的分泌，并有针对性的细胞（K562）的体外模型14杀了外周血单个核细胞。鉴于炎症在香烟烟雾诱导的疾病过程的重要性，对测定条件进一步优化以评价香烟烟雾的免疫调节作用，提出本报告中。
体外测定法通常测量胞内和分泌的细胞因子，以及细胞毒性T细胞和NK细胞对K562细胞的细胞溶解作用杀伤测定法14。该试验涉及预孵化与WS-CM和尼古丁和PBMC的后续刺激s的TLR激动剂历时3天;最终读数是使用酶联免疫测定（ELISA）和/或流式细胞术进行。我们利用细菌脂多糖（LPS），其结合到TLR-4受体，并刺激的PBMC导致产生细胞内细胞因子和细胞因子的分泌。除了各测定步骤的优化，用于评估的TPP，我们还本方法分离的PBMC，细胞死亡测定法，和IL-8的量化的免疫调节作用。这些方法可应用于解决其他研究问题，并进一步细化，以评估烟草制品中的调节上下文。
表1.出版的体外报告和离体方法用于研究烟草产品制剂varilus病理生理作用的CS，香烟烟雾介质。 CSC，香烟烟雾冷凝水; CSE，香烟烟雾提取物; ELISA，酶联免疫吸附测定; GADPH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶;定量PCR，定量聚合酶链反应; RT，实时定量聚合酶链式反应; TS，烟草烟雾。
| 作者（研究年） | Laan 等人（2004） | 穆迪等人（2004） | 奥尔特曼斯等人（2005） | Vayssier（1998年） | Witherden 等人（2004） | 比勒尔等人（2008） |
| 使用电池 | 人支气管内皮细胞（BEAS-2B），人中性粒细胞 | 人肺泡上皮细胞（A549） | 人体气道平滑肌细胞（HASMC） | 人类premonocytic U937细胞，人单核细胞 | II型肺泡上皮细胞（ATII） | 人单核细胞系（THP-1），人肺巨噬细胞 |
| TPP使用 | CSE | CSC | CSE | TS | CSE | CS |
| 使用方法 | ELISA，定量PCR，迁移，电动汽车转变 | 免疫组织化学，电泳，Arrayscan试剂盒，RT-PCR法，酶联免疫吸附 | ELISA法，RT-PCR，定量PCR，电泳 | 凝胶迁移率 | 光显微镜，电子显微镜，电泳，ELISA | 定量PCR，ELISA，E-toxate试剂盒（Sigma），P65平板试验（TRANSAM），电泳，各种免疫试剂盒 |
| 措施 | IL-8，GM-CF，AP-1，NF-κB，迁移 | 组蛋白乙酰转移酶，组蛋白脱乙酰酶，NF-κB，IL-8，等电点κB-α，GADPH | HO-1，GADPH，RANTES，IL-8，趋化因子 | 热休克/应激蛋白（HSP / HSP70），HF转录因子NF-κB，TNF-α的 | 表面活性蛋白（SP-A，SP-C），IL-8，MCP-1，GRO-α，TNF-α，IL-1β，IFN-γ的 | IL-8，IL-1β，IL-6，TNF-α，MIP1-α，GRO-α，MAPK / JNK / ERK磷酸化，cJUN：DNA结合，谷胱甘肽，P65：DNA结合 |
| 最终的结果 | CSE通过抑制AP-1的活化下调细胞因子的产生。 | 的 H 2 O 2与CSC提高组蛋白的乙酰化，减少组蛋白脱乙酰酶活性，差异调节促炎细胞因子的释放。 | 香烟烟雾可能引起的IL-8从HASMC释放，增强由TNF-α，20％CSE更少的IL-8释放，趋化因子的抑制作用和RANTES由香烟烟雾。 | TS激活的HF的转录因子，其用的Hsp70过表达和抑制的NFkB的结合活性和TNF-α的释放相关联。 | 减压ATII细胞衍生趋化因子水平的折衷肺泡拉尔修理，有助于香烟烟雾诱导的肺泡损伤和肺气肿。 | 数据提供机械解释为什么吸烟者增加呼吸道感染。抑制先天应答的伴随增加的IL-8。 |
Protocol
Representative Results
Discussion
我们和其他人已经证实了外周血单个核细胞治疗用的TPP的抑制几种反应，包括表达和细胞因子和功能性的措施，如靶细胞杀死14的分泌。在以前的工作中描述的实验方法需要更长的潜伏期并且是温和的幅度14。鉴于这种诱人的体外模型的潜在应用基础研究和应用研究，我们调查是否有任何在这些多步生物分析测定的参数可以优化。在这里，我们提出了简化的方法来衡量使用TP…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由雷诺烟草公司（RJRT）根据与维克森林大学医学院的合作研究协议投资。 GL Prasad是RJRT的全职员工。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 12 X 75 tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| 2 mL Microtubes | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 3R4F reference cigarettes | Univ. of Kentucky, College of Agriculture | 3R4F | |
| 50 ml conical tubes | Corning | 430828 | |
| 500 ml bottle | Corning | 430282 | |
| 7AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| 96 well flat bottom plate | Termo Nunc | 439454 | |
| 96 well round bottom plates | BD Falcon | 353077 | |
| Cell culture hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 58110R | |
| CFSE | Molecular Probes Life Technologies | C34554 | |
| Cluster tubes | Corning | 4401 | Harmful if swallowed, carcinogen |
| Cytofix/Cytoperm (Permwash) | BD Biosciences | 555028 | Flammable |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide ) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FCAP Array | BD Biosciences | 652099 | Software analyzes CBA data |
| Filter unit | Nalgene | 156-4020 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Canto II | 8 colors, at Ex 405 and Em785. |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Calibur | 4 colors at Ex 495 and Em 785. |
| Flow cytometry analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Freezing Container | Nalgene | 5100-0001 | Contains DMSO, irritant |
| GogliPlug | BD Biosciences | 555029 | Carcinogen, Irritant, Corrosive |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Human Inflammatory Cytokine Kit | BD Biosciences | 551811 | |
| IFN-γ V-500 Antibody | BD Horizon | 561980 | skin sensitizer |
| IL-8 ELISA Kit | R and D Systems | DY208 | |
| Isolation Buffer | Isolymph, CTL Scientific Corp. | 1114868 | Flammable liquid, Irritant |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| L-Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| MIP1-α PE Antibody | BD Pharmingen | 554730 | Acute toxicity, Oral |
| Monensin | Sigma-Aldrich | M5273 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | Acute toxicity, Environmental hazard |
| Parafilm | Bemis | “M” | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Flammable, Skin irritation |
| Pen/strep | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Running buffer | MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech | 130-091-221 | |
| Th1/Th2 CBA Kit | BD Biosciences | 551809 | |
| TNF-α Alexa Fluor 488 Antibody | BioLegend | 502915 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
References
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