तरीके दहनशील तंबाकू उत्पाद की तैयारी के cytotoxicity और प्रतिरक्षादमन का मूल्यांकन करने के लिए
Summary
Using optimized human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) ex vivo assays, we showed that a combustible tobacco product preparation markedly suppresses receptor-mediated intracellularly secreted cytokines and cytolytic ability of effector PBMCs. These rapid assays may be useful in product evaluation and understanding the potential long-term effects of tobacco exposure.
Abstract
अन्य pathophysiological परिवर्तन के अलावा, सिगरेट के धुएं के जीर्ण जोखिम माइक्रोबियल संक्रमण और ट्यूमर घटना के लिए धूम्रपान करने वालों की वृद्धि की संवेदनशीलता से जोड़ा गया है, जो सूजन और प्रतिरक्षा दमन का कारण बनता है। पूर्व vivo मानव परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear में रिसेप्टर की मध्यस्थता प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के दमन (PBMCs) धुआं घटक के साथ इलाज तंत्र का अध्ययन करने और तंबाकू उत्पादों के लिए जोखिम की संभावना दीर्घकालिक प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक आकर्षक दृष्टिकोण है। यहाँ, हम बैक्टीरियल lipopolysaccharide, एक टोल की तरह रिसेप्टर-4 ligand के द्वारा प्रेरित PBMCs का उपयोग करते हुए पूर्व vivo assays के प्रदर्शन करने के तरीकों अनुकूलित। पूरे धुआं वातानुकूलित मध्यम (WS-मुख्यमंत्री) के प्रभाव, एक दहनशील तंबाकू उत्पाद की तैयारी (टीपीपी), और निकोटीन पूर्व vivo assays में PBMCs द्वारा साइटोकाइन स्राव और लक्ष्य सेल हत्या पर जांच की गई। हम बताते हैं कि स्रावित साइटोकिन्स IFN-γ, टीएनएफ, आईएल 10, आईएल -6, और आईएल -8 और intracellular साइटोकिन्स IFN-47 ;, टीएनएफ-α, और एमआईपी-1α था-मुख्यमंत्री उजागर PBMCs में दबा दिया गया। एक K562 लक्ष्य सेल की हत्या परख द्वारा निर्धारित रूप में प्रेरक PBMCs की cytolytic समारोह, भी था-सीएम के लिए जोखिम से कम हो गया था; निकोटीन इन assays में न्यूनतम प्रभावी था। सारांश में, हम पूर्व vivo assays में TPPs के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए सुधार assays के एक सेट मौजूद है, और इन तरीकों आसानी हित के अन्य उत्पादों के परीक्षण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Introduction
हृदय रोग (सीवीडी), क्रोनिक ऑब्सट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज (सीओपीडी) और कैंसर 1,2 सहित पुराने सिगरेट पीने के प्रतिकूल प्रभाव स्वास्थ्य, ज्ञान अंक का एक बड़ा शरीर। लगातार सिगरेट पीने सूजन और प्रतिरक्षा दमन के कारण जाना जाता रहा है, और इन परिवर्तनों धूम्रपान करने वालों के तीन में सूक्ष्म जीवाणु संक्रमण और कैंसर का खतरा बढ़ योगदान करने के लिए रिपोर्ट कर रहे हैं। इन विट्रो और पूर्व vivo तकनीक उपयोगी होते हैं के pathophysiological प्रभाव के आणविक आधार elucidating में सिगरेट के धुएं 4-9 (1 टेबल) और विभिन्न तम्बाकू उत्पादों 10,11 के उभरते विनियमन मार्गदर्शन के लिए महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में पहचाने जाते हैं।
उदाहरण के लिए, हम इस तरह पूरे धुआं वातानुकूलित मध्यम (WS-मुख्यमंत्री) और कुल बात कण (TPM) के रूप में दहनशील तंबाकू उत्पाद की तैयारी (TPPs) कहीं अधिक साइटोटोक्सिक और हानिकारक करने के लिए कर रहे हैं कि दिखा दिया हैगैर दहनशील TPPs या निकोटीन 12,13 से डीएनए। प्रकाशित काम के अनुरूप, यह हाल ही में दहनशील TPPs या निकोटीन 12,13 कि सूचना मिली थी। प्रकाशित काम के अनुरूप, हमने हाल ही में दहनशील TPPs चिह्नित प्रतिरक्षादमन के कारण होता है कि सूचना दी। इस रिसेप्टर (TLR) -ligands तरह Toll- के दमन से सबूत था, एक पूर्व vivo मॉडल 14 में PBMCs द्वारा हत्या (K562) साइटोकाइन स्राव को प्रेरित किया, और सेल को निशाना बनाया। सिगरेट के धुएं प्रेरित रोग प्रक्रियाओं में सूजन के महत्व को देखते हुए सिगरेट के धुएं की प्रतिरक्षा modulatory प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए परख शर्तों के आगे अनुकूलन इस रिपोर्ट में प्रस्तुत किया है।
पूर्व vivo assays के लिए आम तौर पर इंट्रासेल्युलर मापा और साइटोकिन्स के साथ ही assays के 14 की हत्या K562 सेल में साइटोटोक्सिक टी और एन.के. कोशिकाओं की cytolytic समारोह स्रावित। assays के WS-मुख्यमंत्री और निकोटीन और PBMC के बाद उत्तेजना के साथ पूर्व ऊष्मायन शामिलTLR के साथ तीन दिनों की अवधि में agonists; अंतिम readouts एंजाइम से जुड़ी immunosorbent assays के (ELISAs) का उपयोग और / या प्रवाह cytometry प्रदर्शन कर रहे हैं। हम TLR-4 रिसेप्टर्स को बांधता है और PBMCs intracellular साइटोकिन्स और साइटोकिन्स के स्राव के उत्पादन में जिसके परिणामस्वरूप को उत्तेजित करता है, जो जीवाणु lipopolysaccharide (LPS), का उपयोग किया। अलग-थलग PBMCs, कोशिका मृत्यु assays के, और आईएल -8 मात्रा का ठहराव के लिए TPPs, हम भी उपस्थित तरीकों में से immunomodulatory प्रभाव के मूल्यांकन के लिए विभिन्न परख चरणों के अनुकूलन के अलावा। इन विधियों अन्य अनुसंधान सवालों का पता करने के लिए आवेदन किया है और आगे नियामक संदर्भ में तंबाकू उत्पादों का मूल्यांकन करने के लिए परिष्कृत किया जा सकता है।
तालिका 1 में इन विट्रो की खबरों को प्रकाशित और पूर्व vivo विधियों तंबाकू उत्पाद की तैयारी के varilus pathophysiological प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल सीएस, सिगरेट के धुएं मध्यम। सीएससी, सिगरेट का धुआँ घनीभूत; सीएसई, सिगरेट का धुआँ निकालने; एलीएसए, immunosorbent परख एंजाइम से जुड़ी; GADPH, glyceraldehyde 3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज; qPCR, मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन; आर टी, वास्तविक समय मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन; टीएस, तंबाकू का धुआं।
| लेखक (अध्ययन का साल) | Laan एट अल। (2004) | मूडी एट अल। (2004) | Oltmanns एट अल। (2005) | Vayssier (1998) | Witherden एट अल। (2004) | Birrell एट अल। (2008) |
| कोशिकाओं का इस्तेमाल किया | मानव ब्रोन्कियल अन्तःचूचुक कोशिकाओं (ब्यास-2 बी), मानव न्यूट्रोफिल | मानव वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं (A549) | मानव airway के चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (HASMC) | मानव premonocytic U937 कोशिकाओं, मानव monocytes | वायुकोशीय प्रकार द्वितीय उपकला कोशिकाओं (ATII) | मानव monocyticसेल लाइन (THP-1), मानव फेफड़ों मैक्रोफेज |
| टीपीपी इस्तेमाल किया | सीएसई | सीएससी | सीएसई | टीएस | सीएसई | सीएस |
| विधि का इस्तेमाल किया | एलिसा, qPCR, प्रवास, electromobility पारी | Immunohisto-रसायन, वैद्युतकणसंचलन, Arrayscan किट, आरटी पीसीआर, एलिसा | एलिसा, आरटी पीसीआर, qPCR, वैद्युतकणसंचलन | जेल गतिशीलता पारी | लाइट माइक्रोस्कोपी, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, वैद्युतकणसंचलन, एलिसा | qPCR, एलिसा, ई-toxate किट (सिग्मा), P65 थाली परख (TRANSAM), वैद्युतकणसंचलन, विभिन्न Immunoassay किट |
| उपाय | आईएल -8, जीएम-सीएफ, एपी -1, एनएफ-κB, माइग्रेशन | हिस्टोन acetyltransferases, हिस्टोन deacetylases, एनएफ-κB, आईएल -8, पीआई κB-α, GADPH | ओ -1, GADPH, RANTES, आईएल -8, eotaxin | गर्मी झटका / तनाव प्रोटीन (HSP / Hsp70), HF के प्रतिलेखन कारक, एनएफ-κB,टीएनएफ-α | Surfactant प्रोटीन (सपा-ए, सपा-सी), आईएल -8, एमसीपी -1, GRO-α, टीएनएफ-α, आईएल 1β, IFN-γ | आईएल -8, आईएल 1β, आईएल -6, टीएनएफ-α, MIP1-α, gro-α, MAPK / JNK / ERK फास्फारिलीकरण, cJUN: डीएनए बाध्यकारी, Glutathione, P65: डीएनए बाध्यकारी |
| अंतिम परिणाम | सीएसई एपी-एक सक्रियण के दमन के माध्यम से साइटोकाइन उत्पादन नीचे-नियंत्रित करता है। | एच 2 ओ 2 और सीएससी विभिन्न, हिस्टोन deacetylase गतिविधि में कमी, हिस्टोन प्रोटीन की एसिटिलीकरण बढ़ाने proinflammatory साइटोकाइन रिहाई को विनियमित। | सिगरेट के धुएं सिगरेट के धुएं से टीएनएफ-α, 20% सीएसई कम आईएल -8 रिहाई, eotaxin का निषेध और RANTES से बढ़ाकर HASMC से आईएल -8 की रिहाई हो सकती है। | टीएस Hsp70 overexpression और गतिविधि और टीएनएफ-α रिहाई बाध्यकारी NFkB के निषेध के साथ जुड़े थे, जो HF के प्रतिलेखन कारक सक्रिय। | कम ATII सेल व्युत्पन्न केमोकाइन स्तरों समझौता ALVEOLAR मरम्मत, सिगरेट का धुआँ प्रेरित वायुकोशीय नुकसान और वातस्फीति के लिए योगदान दे। | डाटा क्यों धूम्रपान करने वालों की वृद्धि हुई है श्वसन संक्रमण के लिए यंत्रवत स्पष्टीकरण प्रदान करते हैं। सहज प्रतिक्रिया के दमन आईएल -8 में वृद्धि के साथ है। |
Protocol
Representative Results
Discussion
हम और दूसरों को पहले से TPPs साथ PBMCs के उपचार अभिव्यक्ति और साइटोकिन्स और इस तरह के लक्ष्य सेल 14 की हत्या के रूप में कार्य उपायों का स्राव सहित कई प्रतिक्रियाएं, दबा है कि प्रदर्शन किया है। पिछले काम में ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के मेडिसिन जागो वन विश्वविद्यालय के स्कूल के साथ एक सहयोगी अनुसंधान समझौते के तहत आरजे रेनॉल्ड्स तंबाकू कंपनी (RJRT) द्वारा वित्त पोषित है। जीएल प्रसाद RJRT के एक पूर्णकालिक कर्मचारी है।
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 12 X 75 tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| 2 mL Microtubes | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 3R4F reference cigarettes | Univ. of Kentucky, College of Agriculture | 3R4F | |
| 50 ml conical tubes | Corning | 430828 | |
| 500 ml bottle | Corning | 430282 | |
| 7AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| 96 well flat bottom plate | Termo Nunc | 439454 | |
| 96 well round bottom plates | BD Falcon | 353077 | |
| Cell culture hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 58110R | |
| CFSE | Molecular Probes Life Technologies | C34554 | |
| Cluster tubes | Corning | 4401 | Harmful if swallowed, carcinogen |
| Cytofix/Cytoperm (Permwash) | BD Biosciences | 555028 | Flammable |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide ) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FCAP Array | BD Biosciences | 652099 | Software analyzes CBA data |
| Filter unit | Nalgene | 156-4020 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Canto II | 8 colors, at Ex 405 and Em785. |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Calibur | 4 colors at Ex 495 and Em 785. |
| Flow cytometry analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Freezing Container | Nalgene | 5100-0001 | Contains DMSO, irritant |
| GogliPlug | BD Biosciences | 555029 | Carcinogen, Irritant, Corrosive |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Human Inflammatory Cytokine Kit | BD Biosciences | 551811 | |
| IFN-γ V-500 Antibody | BD Horizon | 561980 | skin sensitizer |
| IL-8 ELISA Kit | R and D Systems | DY208 | |
| Isolation Buffer | Isolymph, CTL Scientific Corp. | 1114868 | Flammable liquid, Irritant |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| L-Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| MIP1-α PE Antibody | BD Pharmingen | 554730 | Acute toxicity, Oral |
| Monensin | Sigma-Aldrich | M5273 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | Acute toxicity, Environmental hazard |
| Parafilm | Bemis | “M” | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Flammable, Skin irritation |
| Pen/strep | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Running buffer | MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech | 130-091-221 | |
| Th1/Th2 CBA Kit | BD Biosciences | 551809 | |
| TNF-α Alexa Fluor 488 Antibody | BioLegend | 502915 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
References
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