可燃たばこ製品製剤の細胞毒性および免疫抑制を評価するための方法
Summary
Using optimized human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) ex vivo assays, we showed that a combustible tobacco product preparation markedly suppresses receptor-mediated intracellularly secreted cytokines and cytolytic ability of effector PBMCs. These rapid assays may be useful in product evaluation and understanding the potential long-term effects of tobacco exposure.
Abstract
他の病態生理学的変化の中で、タバコの煙への慢性暴露は、微生物感染症および腫瘍発生に喫煙者の感受性の増加に関連している炎症および免疫抑制を引き起こす。 エクスビボのヒト末梢血単核細胞における受容体媒介性免疫応答の抑制（PBMC）を煙成分で処理されたメカニズムを研究し、タバコ製品への曝露の可能性のある長期的影響を評価するための魅力的なアプローチである。ここでは、細菌性リポ多糖、Toll様受容体4リガンドによって刺激したPBMCを使用してex vivoでのアッセイを実行するための方法を最適化した。全体煙馴化培地（WS-CM）、可燃タバコ製品製剤（TPP）、及びニコチンの効果はサイトカイン分泌に調査し、ex vivoでのアッセイでのPBMCによる細胞死滅を標的とした。者らは、分泌されたサイトカインIFN-γ、TNF、IL-10、IL-6、及びIL-8および細胞内サイトカインIFN-47 ;, TNF-α、およびMIP-1αは、WS-CM-暴露PBMCにおいて抑制された。 K562標的細胞殺傷アッセイによって決定されるエフェクターPBMCの細胞溶解機能は、また、WS-CMへの曝露によって減少した。ニコチンはこれらのアッセイにおける最小有効だった。要約すると、我々は、生体外アッセイにおけるTPPの影響を評価するために改良されたアッセイのセットを提示し、これらの方法は、容易に関心のある他の製品をテストするために適合させることができる。
Introduction
心血管疾患（CVD）、慢性閉塞性肺疾患（COPD）および癌1,2を含む慢性喫煙の健康への悪影響に対する知識ポイントの大幅なボディ。慢性の喫煙は、技術が病態生理学的効果の分子基盤を解明することにおいて有用であり、炎症および免疫抑制を引き起こすことが知られており、これらの変化は、喫煙3における微生物感染および癌の危険性の増大に寄与することが報告されている。 インビトロおよびエキソビボタバコの煙4-9（ 表1）と、様々なタバコ製品10,11の新たな規制を案内するための重要なツールとして認識されている。
例えば、我々は、全煙馴化培地（WS-CM）および総粒子状物質（TPM）などの可燃タバコ製品製剤（のTPP）をはるかに細胞毒性および有害にあることを実証している不燃性のTPPまたはニコチン12,13よりDNA。公表された研究と一致して、最近、可燃のTPPまたはニコチン12,13ことが報告された。発表された研究と一致して、我々は最近、可燃のTPPが著しい免疫抑制を引き起こしたことを報告した。これは、受容体（TLR）-ligands Toll様の抑制によって証明された、サイトカイン分泌を刺激し、細胞（K562） のex vivoモデル14でのPBMCによる殺傷を狙っ。タバコの煙によって誘発される疾患プロセスにおける炎症の重要性を考えると、タバコの煙の免疫調節効果を評価するためのアッセイ条件のさらなる最適化は、このレポートに記載されている。
ex vivoでのアッセイは、典型的に、細胞内および分泌されるサイトカインなどアッセイ14を殺すK562細胞における細胞傷害性T細胞およびNK細胞の細胞溶解機能を測定した。アッセイは、WS-CM及びニコチン及びPBMCのその後の刺激とのプレインキュベーションを含んだ3日間にわたってTLRアゴニストとの;最終的な読み出しは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を用いて、および/またはフローサイトメトリーを行っている。我々は、TLR-4受容体に結合し、細胞内サイトカインおよびサイトカインの分泌の産生をもたらすのPBMCを刺激し、細菌性リポ多糖（LPS）を利用する。単離PBMCを、細胞死アッセイ、およびIL-8の定量化のためのTPP、我々はまた、本発明の方法の免疫調節効果を評価するための様々なアッセイ手順の最適化に加えて。これらの方法は、他の研究課題に対処するために適用され、さらなる調節文脈でタバコ製品を評価するために洗練されてもよい。
表1 のin vitroの報告書を発表し、ex vivoでの方法はたばこ製品製剤のvarilus病態生理学的効果を研究するために使用される CS、タバコの煙媒体。 CSC、タバコの煙凝縮。 CSE、タバコの煙抽出物; ELISA、酵素結合免疫吸着アッセイ; GADPH、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ。定量PCR、定量的ポリメラーゼ連鎖反応。 RT、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応。 TS、タバコの煙。
| 著者（研究の年） | ラーンら （2004） | ムーディら （2004） | Oltmanns ら （2005） | Vayssier（1998） | Witherden ら （2004） | ビレルら （2008） |
| 細胞を使用 | ヒト気管支内皮細胞（BEAS-2B）、ヒト好中球 | 人間の肺胞上皮細胞（A549） | ヒト気道平滑筋細胞（HASMC） | ヒトpremonocytic U937細胞、ヒト単球 | 肺胞II型上皮細胞（ATII） | ヒト単球細胞株（THP-1）、ヒト肺マクロファージ |
| TPP使用 | CSE | CSC | CSE | TS | CSE | CS |
| メソッドの使用 | ELISA、定量PCR、マイグレーション、電気泳動移動度シフト | 免疫組織化学、電気泳動、Arrayscanキット、RT-PCR、ELISA | ELISA、RT-PCR、定量PCR、電気泳動 | ゲル移動度シフト | 光学顕微鏡、電子顕微鏡、電気泳動、ELISA | 定量PCR、ELISA、E-toxateキット（Sigma）を、p65のプレートアッセイ（のTransAM）、電気泳動、種々の免疫アッセイキット |
| メジャー | IL-8、GM-CF、AP-1、NF-κB、移行 | ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、NF-κB、IL-8、pIがκB-α、GADPH | HO-1、GADPH、RANTES、IL-8、エオタキシン | ヒートショック/ストレスタンパク質（HSP / Hsp70が）、HF転写因子、NF-κB、TNF-α | 界面活性剤タンパク質（SP-A、SP-C）、IL-8、MCP-1、GRO-α、TNF-α、IL-1β、IFN-γ | IL-8、IL-1β、IL-6、TNF-α、MIP1-α、GRO-α、MAPK / JNK / ERKリン酸化、cJUN：DNA結合、グルタチオン、P65：DNA結合 |
| 最終結果 | CSEは、AP-1活性化の抑制を介してサイトカイン産生をダウンレギュレートする。 | H 2 O 2とCSC示差的炎症性サイトカインの放出を調節する、ヒストンデアセチラーゼ活性を低下させる、ヒストンタンパク質のアセチル化を高める。 | タバコの煙は、TNF-α、20％CSE少ないタバコの煙によるIL-8放出、エオタキシンおよびRANTESの阻害によって強化、HASMCからのIL-8の放出を引き起こすことがあります。 | TSは、Hsp70の過剰発現およびNFkBの結合活性およびTNF-α放出の阻害に関連したHFの転写因子を活性化した。 | 減少ATII細胞由来ケモカインレベルが肺胞を損なうLAR修理、タバコの煙によって誘発される肺胞の損傷および肺気腫に貢献する。 | データは、喫煙者は呼吸器感染症が増加している理由のための機構的説明を提供する。生得的反応の抑制は、IL-8の増加を伴う。 |
Protocol
Representative Results
Discussion
我々は、他の以前のTPPによるPBMCの処理は、サイトカインおよび14を殺し、標的細胞として機能的措置の発現および分泌を含むいくつかの応答を抑制することを実証した。前作に記載された実験の方法はより長いインキュベーション時間を必要とし、大きさが14で控えめだった。基本のためにこの魅力的なex vivoでモデルの潜在的な応用を考えると応用研究、我々はこれら…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、医学のウェイクフォレスト大学医学部との共同研究契約の下で、RJレイノルズ·タバコ·カンパニー（RJRT）によって資金を供給されている。 GLプラサドはRJRTのフルタイムの従業員である。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 12 X 75 tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| 2 mL Microtubes | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 3R4F reference cigarettes | Univ. of Kentucky, College of Agriculture | 3R4F | |
| 50 ml conical tubes | Corning | 430828 | |
| 500 ml bottle | Corning | 430282 | |
| 7AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| 96 well flat bottom plate | Termo Nunc | 439454 | |
| 96 well round bottom plates | BD Falcon | 353077 | |
| Cell culture hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 58110R | |
| CFSE | Molecular Probes Life Technologies | C34554 | |
| Cluster tubes | Corning | 4401 | Harmful if swallowed, carcinogen |
| Cytofix/Cytoperm (Permwash) | BD Biosciences | 555028 | Flammable |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide ) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FCAP Array | BD Biosciences | 652099 | Software analyzes CBA data |
| Filter unit | Nalgene | 156-4020 | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Canto II | 8 colors, at Ex 405 and Em785. |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Calibur | 4 colors at Ex 495 and Em 785. |
| Flow cytometry analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Freezing Container | Nalgene | 5100-0001 | Contains DMSO, irritant |
| GogliPlug | BD Biosciences | 555029 | Carcinogen, Irritant, Corrosive |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Human Inflammatory Cytokine Kit | BD Biosciences | 551811 | |
| IFN-γ V-500 Antibody | BD Horizon | 561980 | skin sensitizer |
| IL-8 ELISA Kit | R and D Systems | DY208 | |
| Isolation Buffer | Isolymph, CTL Scientific Corp. | 1114868 | Flammable liquid, Irritant |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| L-Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| MIP1-α PE Antibody | BD Pharmingen | 554730 | Acute toxicity, Oral |
| Monensin | Sigma-Aldrich | M5273 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | Acute toxicity, Environmental hazard |
| Parafilm | Bemis | “M” | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Flammable, Skin irritation |
| Pen/strep | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Running buffer | MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech | 130-091-221 | |
| Th1/Th2 CBA Kit | BD Biosciences | 551809 | |
| TNF-α Alexa Fluor 488 Antibody | BioLegend | 502915 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
References
- . . How Tobacco Smoke Causes Disease: The Biology and Behavioral Basis for Smoking-Attributable Disease, A Report of the Surgeon General. , (2010).
- Zeller, M., Hatsukami, D. The Strategic Dialogue on Tobacco Harm Reduction: a vision and blueprint for action in the US. Tob. Control. 18, 324-332 (2009).
- Sopori, M. Effects of cigarette smoke on the immune system. Nature Reviews Immunology. 2, 372-377 (2002).
- Birrell, M. A., Wong, S., Catley, M. C., Belvisi, M. G. Impact of tobacco-smoke on key signaling pathways in the innate immune response in lung macrophages. J. Cell Physiol. 214, 27-37 (2008).
- Laan, M., Bozinovski, S., Anderson, G. P. Cigarette smoke inhibits lipopolysaccharide-induced production of inflammatory cytokines by suppressing the activation of activator protein-1 in bronchial epithelial cells. J. Immunol. 173, 4164-4170 (2004).
- Moodie, F. M., et al. Oxidative stress and cigarette smoke alter chromatin remodeling but differentially regulate NF-kappaB activation and proinflammatory cytokine release in alveolar epithelial cells. Faseb J. 18, 1897-1899 (2004).
- Oltmanns, U., Chung, K. F., Walters, M., John, M., Mitchell, J. A. Cigarette smoke induces IL-8, but inhibits eotaxin and RANTES release from airway smooth muscle. Respir. Res. 6, 74 (2005).
- Vayssier, M., Favatier, F., Pinot, F., Bachelet, M., Polla, B. S. Tobacco smoke induces coordinate activation of HSF and inhibition of NFkappaB in human monocytes: effects on TNFalpha release. Biochem. Biophys. Res. Commun. 252, 249-256 (1998).
- Witherden, I. R., Vanden Bon, E. J., Goldstraw, P., Ratcliffe, C., Pastorino, U., Tetley, T. D. Primary human alveolar type II epithelial cell chemokine release: effects of cigarette smoke and neutrophil elastase. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 30, 500-509 (2004).
- Hatsukami, D. K., Biener, L., Leischow, S. J., Zeller, M. R. Tobacco and nicotine product testing. Nicotine Tob. Res. 14, 7-17 (2012).
- Ashley, D. L., Backinger, C. L., van Bemmel, D. M., Neveleff, D. J. Tobacco Regulatory Science: Research to Inform Regulatory Action at the Food and Drug Administration’s Center for Tobacco Products. Nicotine Tob. Res. , (2014).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Bombick, B., Borgerding, M. F., Prasad, G. L. Evaluation of cytotoxicity of different tobacco product preparations. Regul. Toxicol. Pharmacol. 64, 350-360 (2012).
- Gao, H., Prasad, G. L., Zacharias, W. Differential cell-specific cytotoxic responses of oral cavity cells to tobacco preparations. Toxicol In Vitro. , (2012).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Prasad, G. L. Combustible and non-combustible tobacco product preparations differentially regulate human peripheral blood mononuclear cell functions. Toxicol. In Vitro. 27, 1992-2004 (2013).
- Arimilli, S., Damratoski, B. E., Chen, P., Jones, B. A., Prasad, G. L. Rapid isolation of leukocyte subsets from fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells in clinical research. Cryo Letters. 33, 376-384 (2012).
- Schmid, I., Krall, W. J., Uittenbogaart, C. H., Braun, J., Giorgi, J. V. Dead cell discrimination with 7-amino-actinomycin D in combination with dual color immunofluorescence in single laser flow cytometry. Cytometry. 13, 204-208 (1992).
- Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J. Immunol. Methods. 325, 51-66 (2007).
- Taga, K., Yamauchi, A., Kabashima, K., Bloom, E. T., Muller, J., Tosato, G. Target-induced death by apoptosis in human lymphokine-activated natural killer cells. Blood. 87, 2411-2418 (1996).
