Abstract
Anopheles gambiae arter Komplekset inneholder den store malaria overføring mygg i Afrika. Fordi disse arter er av en slik medisinsk betydning, karakterisert flere trekk er vanligvis ved hjelp av molekylære assays for å hjelpe til i epidemiologiske undersøkelser. Disse egenskapene inkluderer artsbestemmelse, insektmiddel motstand, parasitt infeksjon status, og vert preferanse. Siden populasjoner av Anopheles gambiae komplekset er ikke skilles morfologisk, er en polymerase kjedereaksjon (PCR) som tradisjonelt brukes for å identifisere arter. Når den art som er kjent, er flere nedstrøms-analyser rutinemessig utført for å belyse ytterligere kjennetegn. For eksempel mutasjoner kjent som KDR i en para-genet gir resistens mot DDT og pyretroide insektmidler. I tillegg, blir enzym-bundne immunosorbentbestemmelser (ELISA) eller plasmodiumparasitten DNA gjenkjenning PCR-analyser brukes til å detektere parasitter tilstede i mygg vev. Til slutt, en Oppkjøpn av PCR, og restriksjonsenzymdigere kan brukes til å belyse verts preferanse (f.eks human vs. dyreblod) ved screening av mygg bloodmeal for vertsspesifikk DNA. Vi har utviklet en multi-deteksjonsanalyse (MDA) som kombinerer alle de ovenfor nevnte analysene, til én multipleks reaksjonen genotyping 33SNPs for 96 eller 384 prøver på en gang. Fordi MDA inkluderer flere markører for arter, Plasmodium deteksjon, og vert blod identifikasjon, er sannsynligheten for å generere falske positiver eller negativer sterkt redusert fra tidligere analyser som omfatter bare én markør per trekk. Denne robuste og enkle analysen kan oppdage disse viktige myggtrekk kostnadseffektivt og i en brøkdel av tiden av eksisterende analyser.
Introduction
Anopheles arabiensis, Anopheles coluzzii og Anopheles gambiae er de viktigste vektorer som er ansvarlige for malaria overføring i Afrika en. Disse tre artene er ikke skilles morfologisk 2 og kan bare skilles ved molekylære assays 3-9. I tillegg er det mange nedstrøms analyser rutinemessig gjennomført for å hjelpe epidemiologiske og populasjonsgenetikk studier. Disse omfatter (1) en genotyping analysen for arts øyer 10-12, (2) en genotyping analysen erkjenner ikke synonymt SNPs i 1014 th aminosyre kodon stilling para genet (knock-down motstand, eller kdr, SNP) 13 -18, (3) parasitt gjenkjenning PCR 19-23, og (4) screening for vertsspesifikk DNA i mygg midguts 24,25.
Vi utviklet en multi-gjenkjenning analysen (MDA) som kombinerer alle disse analysene til en enkelt multipleks reaksjon med mål om enalyzing epidemiologisk viktige kjennetegn ved malaria vektorer i Afrika. MDA analysen inkluderer flere markører for deteksjon (1) arter (A. arabiensis, A. gambiae, A. coluzzii eller annen (ingen av de tre)), (2) insektmiddel motstand representert i kdr SNPs (både L1014F og L1014S) , (3) nærværet av to store malariaparasitter, Plasmodium falciparum og P. vivax, og (4) blod kilde fra en avian og seks pattedyr verter.
Tradisjonelt ble disse analyser utført i separate polymerase kjedereaksjoner. Når alle disse analysene er gjort ved hjelp av en konvensjonell PCR plattform, krever det å drive 8-10 PCR reaksjons analyser og tilhørende gelelektroforesesystemer trinn. Hver enkelt PCR reaksjon fra forberedelse til å dokumentere resultater tar 4-5 timer, mens MDA Metoden som presenteres her tar ca 5 timer i helheten. Dette tilsvarer en 90% besparelse i lønnskostnader alene. MDA presenteres her koster $ 5per prøve å genotype alle 33 SNPs. Dette er betydelig rimeligere enn de enkle agarosegel baserte analyser, som koster ca $ 1,50 per prøve. Assays detektere alle kjennetegn som omfattes av MDA ville kreve et minimum av 8-10 separate agarosegel-baserte assays til en kostnad på $ 12 til 15 per prøve. Videre MDA reduserer sjansen for å generere et falskt positivt eller negativt ved å benytte minst tre markører for hver parasitt eller vertskilde deteksjon.
Plattformen vi utnyttet er ikke begrenset til malaria vektorer, men kan brukes i en rekke programmer som medisin, veterinærmedisin, og grunnleggende biologi 26-28. Inngående assosiasjonsstudier eller populasjonsgenetikk studier som involverer en stor (i rekkefølge av 100s) antall prøver krever kostnadseffektive analyser screening for flere markører samtidig. De fleste studier som bruker to eller flere separate PCR-analyser kunne implementere MDA for raskere resultater til en lavere kostnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. PCR Amplification
- Bland alle PCR primere (Se utfyllende tabell S1) i en 1,5 ml mikrorør. Hver SNP har to primere (forover og bakover). Sørg for at aksjen konsentrasjonen av hver PCR primer holdes på 100 mikrometer. Gjør nok primerblanding for 500-1000 reaksjoner å redusere pipetteringsfeil og tid på benken (Se utfyllende tabell S2). Dersom det er ønskelig, forberede porsjoner for 100-200 reaksjoner per tube og oppbevares ved -20 ° C.
- Forbered PCR cocktail som beskrevet i produsentens protokoll (tabell 1). Volumet for 96 reaksjoner inkluderer et overheng på 20%. Vortex røret som inneholder PCR-cocktail lett og sentrifuger i 30 sekunder ved 2000 x g.
- Dispensere 3 ul av PCR-cocktail i hver brønn av en ikke-gikk langs 96 brønn plate. En repeater pipette kan spare tid for denne prosessen.
- Tilsett 2 ul av den passende genomiske DNA av mygg i hver brønn.
MERK: Prosessen med å skaffe genomisk DNA fra m osquito vev (hode / thorax, abdomen eller hele kroppen) er beskrevet i andre litteratur 29-32. Velg en passende DNA ekstraksjon protokoll for å skille de med Plasmodium i blodet (abdomen) fra smitte mygg (Plasmodium i hodet / thorax). Vi bruker vanligvis DNA ekstrahert fra kroppsdeler (hode / thorax eller magen) av mygg, så DNA konsentrasjonen varierer fra 0.05-2ng / mikroliter. Selv om den totale DNA-inngang er lavere enn produsentens anbefaling (5-10ng / Rxn), vi vanligvis får robust SNP samtaler fra 98% av DNA-prøver uten hele genomet forsterkning. - Tett plate, forsiktig blande eller vortex, og sentrifuger i 1 min på 370 x g.
- Bruke følgende thermocycler protokollen for å utføre PCR-amplifikasjon: (1) 94 ° C i 2 min, (2) 94 ° C i 30 sekunder, (3) 56 ° C i 30 sek, (4) 72 ° C i 1 min , (5) gjenta trinn (2) - (4) i 45 sykluser, (6) 72 ° C i 1 min, og 4 ° C hold.
- Klargjør SAP enzymoppløsning i en 96-brønners plate (Se tabell 2). Prosess 96 prøver i en plate. Volumet for 96 reaksjoner inkluderer et overheng på 20%.
- Vortex røret av SAP enzymoppløsning lett og sentrifuger i 30 sekunder ved 2000 x g. Dispensere 2 mL av SAP enzymløsning i hver brønn. Igjen kan en repeater pipette spare tid for denne prosessen.
- Tett plate, forsiktig blande eller vortex, og sentrifuger i 1 min på 370 x g. Inkuber platen som følger: (1) 37 ° C i 40 minutter, (2) 85 ° C i 5 minutter for å inaktivere enzymet, (3) 4 ° C hold. Ved fullføring av dette trinn, lagre platen ved -20 ° C før fortsetter. Behandle lagret plate innen 2 uker.
3. SNP Extension
- Hvis prøven plate er frosset etter SAP behandling, la den tine i romtemperatur før du fortsetter.
- Forberede utvidelsen primerblandingen (Supplemental tabell S2). Hver SNP har en extension primer. Holde lager konsentrasjon av hver forlengelse primer 500 uM. Eventuelt delmengde for 100-200 reaksjoner per tube og butikk ved -20 ° C.
- Forberede utvidelse mix som beskrevet i tabell 3. 96 reaksjon volum inkluderer et overheng på 20%.
- Vortex røret for forlengelse cocktail lett og sentrifuger i 30 sekunder ved 2000 x g. Dispensere 2 mL av forlengelse cocktail i hver brønn. Igjen kan en repeater pipette spare tid for denne prosessen.
- Tett plate, forsiktig blande eller vortex, og sentrifuger i 1 min på 370 x g. Thermocycle platen som vist i figur 1. Ved dette punkt fortsetter til massespektrometri eller lagre platen ved -20 ° C opp til 2 uker.
4. Conditioning SNP Extension Product å optimalisere massespektrometrianalyse
- Hvis prøven plate er frosset etter SNP forlengelse, la den tine i romtemperatur før du fortsetter.
- Overføre 15mg av harpiks fra sin ContaIner på smilehull plate ved hjelp av en langstrakt skje. Bruk skrapen til å spre harpiks inn i brønnene av fordypningen plate. Feie skrapen fra side til side over smilehull plate for å spre harpiks. Pass på at det er harpiks i hver brønn.
- Skrape overflødig resin av smilehull platen med skrapen. La harpiksen stå i fordypningen platen i minst 20 min. Samtidig som harpiksen stå i fordypningen plate, tilsett 41 pl av HPLC-kvalitet vann til hver brønn av prøveplaten.
- Forsiktig plassere prøven platen opp-ned, på smilehull plate. Sørg for at prøven plate nullstilles mot den lille avrundet innlegget i smilehull plate, som setter de brønnene i utvalget plate med brønnene i smilehull plate.
- Å holde prøven plate og fordypningen platen sammen, forsiktig snu dem, slik at harpiksen faller ut av fordypningen platen inn i brønnene i prøveplaten. Pek på smilehull platen slik at harpiksen faller ut i prøveskilt. Sørg for at alle harpiksen i dimple plate faller ut i prøveplatebrønnene. Sentrifuger plate ved 3200 xg i 30 sek.
- Rotere prøveplate på en rotator i 5 min ved RT. Rotator må rotere prøveplate 360 ° om den lange aksen.
- Sentrifugere prøven plate ved 3200 xg i 5 min. Etter dette trinnet, bør du oppbevare prøven plate ved -20 ° C opp til 2 uker før du går videre til neste trinn.
5. MALDI-TOF massespektrometri
- Overføre den betingede SNP forlengelse produktet på en bioarray som SpectroCHIP i henhold til produsentens instruksjoner. Vi bruker MassArray Nanodispenser for dette trinnet.
- Når overføringen er fullført, definere hvordan analyser og platene er å bli satt opp i analysen database. Navngi analysen og plater slik at hver plate har en unik identifikator som linker til spesifikke analyse design (Supplemental tabell S3).
- Etter analysen og plate er definert, erverve spektra bruker et massespektrometer.
- Utføre dataanalyse ved hjelp av en real-time PCR-analyse data tolkning programvare som Typer Analyzer eller TyperViewer (Sequenom). Innhente data i XML-format som inneholder prøven layout, Massespektrogrammet for hver brønn, vil markøren informasjon, inkludert navn, forventet masse for hver variant av den tilsvarende SNP, og eventuelle feil eller advarsler knyttet til hver reaksjon. Se figur 2 for den resulterende masse spektrogram.
- Utføre SNP genotype klyngeanalyse ved å sette deteksjonsterskelen (magnitude eller signal-til-støy-forhold) og toleranse / varians er tillatt for hver genotype. Figur 3 viser et eksempel på en 04707-KDR # 2 SNP genotypen klynger.
- Eksportere de resulterende SNP genotype samtalene til et regnearkprogram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Artsidentifisering:
Følgende fem SNPs sammen identifisere tre arter (A. arabiensis, A. coluzzii og A. gambiae) (tabell 4). Dersom en prøve er ikke en av de tre artene, de tre SNPs (01073-213, 04679-157 og 10313 -052) ikke klarer å forsterke.
kdr genotype for dedusere insektmiddel motstand:
Den 1014 th kodon av para spenningsavhengige natriumkanal tilsvarer kdr. To SNPs på 2. og 3. base av de 1014 th kodon bestemme de tre mulige aminosyrer. . De mulige kombinasjoner av genotypene er oppført i tabell 5 Denne SNP fungerer for tre arter av afrikanske malaria vektorer: A. arabiensis, A. coluzzii og A. gambiae. Disse SNPs klarer å forsterke i A. darlingi, en brasiliansk malaria vektor. Dette er ikkeoverraskende, gitt at mitokondrie genome sekvenslikhet mellom A. darlingi og A. gambiae er bare 88.9% mens mitokondrielle genom sekvenslikhet mellom tre afrikanske malaria vektorer er over 98%. Andre arter har ikke blitt testet. Vi var vellykket i forsterkning fra prøver samlet i Mali, Kamerun, Tanzania og Zambia.
Plasmodium deteksjon:
Hvis intakt Plasmodium DNA er til stede i mygg vev, forventer vi å oppdage P. falciparum eller P. vivax spesifikk DNA blant DNA-prøven ekstraheres fra mygg. Artsspesifikke SNPs ble identifisert fra sekvens innretting av cytokrom b sekvens av 123 P. falciparum, 97 P. vivax, 11 P. malariae og 18 P. ovale isolere sekvenser fra Afrika tilgjengelig på Genbank. Vi laget 6 SNPs som produserer unike SNP genotyper å skille P. falciparum eller P. VI VAX fra andre Plasmodium-arter (tabell 6). Vi har testet denne analysen på mygg prøver samlet i Mali, Kamerun, Tanzania, Zambia og Brasil, og bekreftet at dette bestemt sett av markører fungerer uavhengig av myggarter.
Bloodmeal deteksjon PCR:
Cytokrom b sekvenser fra syv vertsarter (menneske, kylling, ku, hund, geit, gris og sau) ble samlet inn fra Genbank og konsensussekvenser ble generert. SNPs informative for hver vert ble deretter valgt for genotyping. Vi testet dette med blod kilder fra syv forskjellige dyr (Tabell 7).
Fordi PCR-fragmenter er korte (80-120 bp), fungerer dette på noe degradert DNA eller på delvis fordøyde bloodmeals fra mygg vev. Sannsynligheten for falske positive samtaler er sterkt redusert ved å ha flere markører per host type.
s ">
Figur 1. Thermocycler program for SNP forlengelsestrinn. Forsterkningen syklus er i alt 200 (5x40).
Figur 2. Masse-spektrogram for MDA. X-aksen er masse (Da) av SNP ekstensjonsprodukter og Y-aksen er signalintensiteten. De røde linjene indikerer den forventede massen av Uinkorporert Extension primer, SNP allel 1 og allel 2 for den valgte markør. Indikerer forventet grå linjer masse av andre markører i MDA. Denne tomten er generert fra dataanalyse programvare (Typer Analyzer eller Typer Viewer) fra utgangsdatafilen etter trinn 5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
e = "always"> 
Figur 3. Individuell SNP genotype klynge vise X-aksen er arctangens verdi (betegnet som "vinkel") av signalintensitetene av SNP-allel og en SNP allel 2. Y-aksen er størrelsen av genotype anropssignal. Denne tomten er gitt i dataanalyse programvare (Typer Analyzer eller Typer Viewer). Noen spesielle data kan velges med et klikk på en museknapp og valgte eksempel data vises med sirkel. Clustering analyse gitt i programvare klynger genotyper med en brukerdefinert varianseterskelen og automatisk farger tre genotyper av en biallelic SNP. Eksempel vist her indikerer homozygot T (TT) individer som blå trekanter, heterozygote (TA) som grønne firkanter og homozygot A (AA) individer som oransje invertert trekanter. Røde sirkler representerer Ingen samtale (ingen forsterkning).t = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Reagens | Konsentrasjon i 5 pl | Volum | Volum |
| (1 Rxn) | (96 rxns) | ||
| Vann (HPLC-kvalitet) | NA | 0,8 mL | 92,2 mL |
| 10 x PCR-buffer med 20 mM MgCl2 | 1x (2 mM MgCl2) | 0,5 pl | 57,6 mL |
| MgCl2 (25 mM) ** | 2 mm | 0,4 mL | 46.1 mL |
| dNTP mix (25 mM hver) *** | 500 mikrometer | 0,1 mL | 11.5 mL |
| Primerblandingen (500 nM hver) | 100 nM | 1,0 mL 115,2 mL | |
| PCR Enzyme (5 U / mikroliter) | 1,0 U / Rxn | 0,2 mL | 23.0 mL |
| Totalt volum: | 3,0 mL | 345,6 mL |
Tabell 1. Multiplex PCR cocktail oppskrift. Volumet av hvert reagens for PCR forlengelsestrinn for en reaksjon og 96 reaksjon med en 20% overheng.
| Reagens | Volum (1 Rxn) | Volum (96 Rxn) |
| Vann (HPLC-kvalitet) | 1.53 mL | 176,3 mL |
| SAP Buffer (10x) | 0,17 mL | 19.6 mL |
| SAP enzym (1,7 U / mikroliter) | 0.30 mL | 34,6 mL | 2,00 mL | 230,4 mL |
Tabell 2. SAP-enzymløsning. Volumet av hvert reagens for alkalisk rekefosfatase behandling for en reaksjon og 96 reaksjon med en 20% overheng.
| Reagens | Kons. I 9 mL | Volum (1rxn) | Volum (96 rxns) |
| Vann (HPLC-kvalitet) | NA | 0,6190 mL | 71,3 mL |
| iPLEX Buffer Plus (10x) | 0.222x | 0,2000 mL | 23.0 mL |
| iPLEX Oppsigelse mix | 1x | 0,2000 mL | 23.0 mL |
| Extension Primer mix | 0,9400 mL | 108.3 pl | |
| iPLEX enzym | 1x | 0,0410 mL | 4,7 mL |
| Total Volume | 2,0000 mL | 230,4 mL |
Tabell 3. SNP Extension cocktail Volumet av hvert reagens for SNP forlengelsestrinn for en reaksjon og 96 reaksjon med en 20% overheng.
Tabell 4. SNP genotyper for hver art. 28S IGS-540, 28S IGS-649 og 01073-213 ligger på X-kromosomet, 04679-157 er på kromosom 2 og 10313-052 er på kromosom 3. Hybrid genotype (heterozygote) er markert med gult. Fast variant i A. coluzzii er markert i lyseblått og fast variant i A. gambiae er merket i mørketblå.
Tabell 5. SNP genotyper for kdr. To SNPs KDR # 1 og KDR # 2 utgjør en genotype for 1014 th kodon av para-genet. Den første base er uforanderlig, så det ikke blir tatt med i analysen. Mottakelige homozygote genotyper er merket med blått. Den mest motstandsdyktig L1014F homozygot genotype er markert i mørk blå. Gul farge indikerer heterozygote. Den L1014 S, intermediately motstandsdyktig genotype, vises i oransje.
Tabell 6. SNP genotyper for P. falciparum og P. vivax ong>. Totalt 6 SNPs brukes til å bestemme tilstedeværelsen av malariaparasitten. Pl-0041, Pl-1269 og Pl-1549 inneholder P. falciparum spesifikke alleler (G, T og T henholdsvis). Samtidig amplifisering av de tre allelene indikerer tilstedeværelse av forholdsvis intakt P. falciparum DNA i prøve-DNA. Forsterkning av alternative alleler (A for Pl-0041 og Pl-1269) indikerer tilstedeværelse av andre Plasmodium arter (f.eks, P. vivax, P. ovale eller P. malariae) i prøven. Pf-1549 ligger i regioner med mange flere P. falciparum spesifikk flankerer regioner dermed denne SNP blir bare forsterket når P. falciparum er til stede. Pl-0071, Pl-1245 og Pl-0157 inneholder P. vivax spesifikke alleler (G, G og T henholdsvis). Amplifikasjon av alternative alleler (A, A og C henholdsvis) indikerer nærværet av andre Plasmodium-DNA i prøven. Infiserte mygg vil ikke ha noen forsterkning på alle 6 markører. 
Tabell 7. SNP genotyper for 7 verter:. Human, kylling, ku, hund, geit, gris og sau "NC" står for "No Call" (ingen forsterkning) i tabellen nedenfor. Vær oppmerksom på at noen ikke-spesifikk forsterkning kan oppstå på noen loci, men ikke for alle SNPs av en bestemt vert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MDA er sammensatt av fem store trinn: PCR forsterkning, reker alkalisk fosfatase (SAP) reaksjon, SNP forlengelse, utvidelse produkt condition, og matrise-assistert laserdesorpsjon / ionisering - flyvetid (MALDI-TOF) massespektrometri 33-37. Den første PCR amplifikasjonstrinn forsterker DNA flankerer hver SNP, slik at nok mal DNA vil være tilgjengelig på SNP forlengelse trinn. SAP reaksjon nøytraliserer ubrukte dNTPs som kan forstyrre følgende SNP forlengelse trinn. SNP forlengelse involverer en enkelt ekstensjonsprimer per SNP locus og masse modifisert terminator nukleotider. 3'-enden modifiserte nukleotider forhindre påfølgende nukleotider fra å bli innlemmet i forlengelsen primer. Således massen av enkeltbase indikerer genotypen av den tilsvarende SNP.
Den mest kritiske trinnet i å sikre suksess for denne tilnærmingen er å ha en god datasett av eksisterende polymorfismer i målorganismens. Vi brukte vel karakteriserte SNPs for artsidentifisering (N> 900) 10,12,38-40 og kdr (N> 1000) 15,18. Artsspesifikke SNPs for Plasmodium ble identifisert fra sekvens justering av cytokrom b sekvenser av 123 P. falciparum, 97 P. vivax, 11 P. malariae og 18 P. ovale isolere sekvenser fra Afrika som var tilgjengelig på Genbank. Cytokrom b sekvenser fra syv vertsarter (menneske, kylling, ku, hund, geit, gris og sau) ble samlet inn fra Genbank for vertsspesifikk SNP identifikasjon. Basert på denne store kroppen av sekvensdata, var vi i stand til å designe en robust diagnostisk analyse ved hjelp av en analyse designer programvare.
Antallet markører hver reaksjon kan romme bestemmes av den biokjemiske kompatibiliteten til primerblandingen gitt en toleranse for primer-dimer potensial (0,9 0-1 skala). Forfattere brukes standardverdien (1; mest streng) for falsk priming potensial. Relaxation av denne parameteren kan potensielt øke antallet SNP'er som kan analyseres i en enkel reaksjon i tillegg til den SNP'er inkludert i denne studien.
PCR-forsterkningstrinn er robuste og vanligvis ikke krever justering av den innledende analysedesign. SNP forlengelse blanding (tabell 3), men kan trenge modifisering i relative mengde av hver primer ved hjelp av massespektrometri for å sikre et tilstrekkelig signal-til-støy-forholdet oppnås for hver primer. Den angitte SNP ekstensjonsprimer oppskrift er resultatet av slike justeringer. Kompatibilitet mellom forlengelses primere kan begrense det totale antall SNP'er som kan være multiplekset i en eneste reaksjon. Siden reaksjonsvolumet er lite (5-8 ul), må prøveplaten å bli skikkelig forseglet for å forhindre fordampning under amplifikasjon trinn.
Denne plattformen kan samtidig scorer opptil 35 SNPs per reaksjon, mens andre SNP genotyping plattformer kan accommodate over tusen SNPs per reaksjon 41. Med utviklingen innen genomsekvensering teknologi, kan man skaffe millioner av SNPs bruke neste generasjons sekvense 29,42,43. Men teknikken som brukes her gir et ideelt program for studier som krever genotyping et relativt lite antall markører for mange (100s-1000-årene) individer. Ytterligere drøfting av design begrensninger av forskjellig SNP genotyping plattformen er dekket i tidligere studier 41.
MDA er rettet mot å karakterisere epidemiologisk viktige trekk av malaria vektorer og gir en ideell protokoll for medium-throughput SNP genotyping analyser analysere tusenvis av mygg samlet inn fra naturlige populasjoner. MDA presenteres her gir (1) over en 90% reduksjon i arbeidstiden, (2) en 60% reduksjon i reagens-kostnader, og (3) reduksjon av falske positive / negative ved å benytte flere markører. Den foreslåtte analysen kan forbedre epidemiologiske studier avsterkt til rette for innsamling av data. Dessuten kan det forbedre genomassosiasjonsstudier ved karakter mygg prøver med hensyn til opprinnelse befolkningen, insektmiddel motstand, parasitt mottakelighet og vert valg. Endelig kan denne MDA gi inspirasjon og en mal for utforming av andre multiplex analyser ved hjelp av et MALDI-TOF basert SNP genotyping plattform.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi takker legene. Anthony Cornel og Laura Norris ved UC Davis og Dr. Katharina Kreppel ved Universitetet i Glasgow for å gi mygg prøver fra Tanzania. Vi takker Ms Smita Das og Dr. Douglas Norris fra Johns Hopkins School of Public Health for å dele mygg prøver fra Zambia. Vi takker også Mr. Lee V. Millon ved Veterinær Genetics Laboratory for trening på analyse design. Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Health gi R01AI 078183 og R21AI062929.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MassARRAY Analyzer Compact | Sequenom | MT9 | MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids. |
| MassARRAY Nanodispenser | Sequenom | RS1000 | Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP |
| iPLEX Gold Genotyping Reagent Set | Sequenom | 10158 | Reagents used for iPLEX assay including SAP kit. |
References
- Ayala, F. J., Coluzzi, M. Chromosome speciation: humans, Drosophila, and mosquitoes. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, Suppl 1. 6535-6542 (2005).
- Coetzee, M., Craig, M., le Sueur, D. Distribution of African malaria mosquitoes belonging to the Anopheles gambiae complex. Parasitol Today. 16, 74-77 (2000).
- Favia, G., Lanfrancotti, A., Spanos, L., Siden-Kiamos, I., Louis, C. Molecular characterization of ribosomal DNA polymorphisms discriminating among chromosomal forms of Anopheles gambiae s.s. Insect Mol Biol. 10, 19-23 (2001).
- Fanello, C., Santolamazza, F., Torre, della, A, Simultaneous identification of species and molecular forms of the Anopheles gambiae complex by PCR-RFLP. Med Vet Entomol. 16, 461-464 (2002).
- Santolamazza, F. Comparative analyses reveal discrepancies among results of commonly used methods for Anopheles gambiae molecular form identification. Malar J. 10, 215 (2011).
- Santolamazza, F. Insertion polymorphisms of SINE200 retrotransposons within speciation islands of Anopheles gambiae molecular forms. Malar J. 7, 163 (2008).
- Santolamazza, F., Della Torre, A., Caccone, A. Short report: A new polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism method to identify Anopheles arabiensis from An. gambiae and its two molecular forms from degraded DNA templates or museum samples. Am J Trop Med Hyg. 70, 604-606 (2004).
- Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol Resour. , (2013).
- Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. Identification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by the polymerase chain reaction. Am J Trop Med Hyg. 49, 520-529 (1993).
- White, B. J., Cheng, C., Simard, F., Costantini, C., Besansky, N. J. Genetic association of physically unlinked islands of genomic divergence in incipient species of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 19, 925-939 (2010).
- Hahn, M. W., White, B. J., Muir, C. D., Besansky, N. J. No evidence for biased co-transmission of speciation islands in Anopheles gambiae. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 367, 374-384 (2012).
- Lee, Y., Marsden, C. D., Nieman, C., Lanzaro, G. C. A new multiplex SNP genotyping assay for detecting hybridization and introgression between the M and S molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol Resour. 14, 297-305 (2014).
- Reimer, L. Relationship between kdr mutation and resistance to pyrethroid and DDT insecticides in natural populations of Anopheles gambiae. J Med Entomol. 45, 260-266 (2008).
- Weill, M. The kdr mutation occurs in the Mopti form of Anopheles gambiae s.s. through introgression. Insect Mol Biol. 9, 451-455 (2000).
- Tripet, F. Longitudinal survey of knockdown resistance to pyrethroid (kdr) in Mali, West Africa, and evidence of its emergence in the Bamako form of Anopheles gambiae s.s. Am J Trop Med Hyg. 76, 81-87 (2007).
- Martinez-Torres, D. Molecular characterization of pyrethroid knockdown resistance (kdr) in the major malaria vector Anopheles gambiae s.s. Insect Mol Biol. 7, 179-184 (1998).
- Diabate, A. KDR mutation, a genetic marker to assess events of introgression between the molecular M and S forms of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) in the tropical savannah area of West Africa. J Med Entomol. 40, 195-198 (2003).
- Chandre, F. Current distribution of a pyrethroid resistance gene (kdr) in Anopheles gambiae complex from west Africa and further evidence for reproductive isolation of the Mopti form. Parassitologia. 41, 319-322 (1999).
- Fornadel, C. M., Norris, L. C., Franco, V., Norris, D. E. Unexpected anthropophily in the potential secondary malaria vectors Anopheles coustani s.l. and Anopheles squamosus in Macha, Zambia. Vector Borne Zoonotic Dis. 11, 1173-1179 (2011).
- Snounou, G. High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction. Molecular and biochemical parasitology. 61, 315-320 (1993).
- Singh, B. A genus- and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies. Am J Trop Med Hyg. 60, 687-692 (1999).
- Oyedeji, S. I. Comparison of PCR-based detection of Plasmodium falciparum infections based on single and multicopy genes. Malar J. 6, 112 (2007).
- Gama, B. E. Real-time PCR versus conventional PCR for malaria parasite detection in low-grade parasitemia. Experimental parasitology. 116, 427-432 (2007).
- Kent, R. J., Norris, D. E. Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome. B. Am J Trop Med Hyg. 73, 336-342 (2005).
- Fornadel, C. M., Norris, D. E. Increased endophily by the malaria vector Anopheles arabiensis in southern Zambia and identification of digested blood meals. Am J Trop Med Hyg. 79, 876-880 (2008).
- Teeter, K. C. The variable genomic architecture of isolation between hybridizing species of house mice. Evolution. 64, 472-485 (2010).
- Han, J. Y. A genome-wide association study of survival in small-cell lung cancer patients treated with irinotecan plus cisplatin chemotherapy. The pharmacogenomics journal. 14, 20-27 (2014).
- Chakraborti, S. Interaction of polyethyleneimine-functionalized ZnO nanoparticles with bovine serum albumin. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 28, 11142-11152 (2012).
- Marsden, C. D. Diversity, differentiation, and linkage disequilibrium: prospects for association mapping in the malaria vector Anopheles arabiensis. G3 (Bethesda). 4, 121-131 (2014).
- Methods in Anopheles Research. , Second edition, MR4. Available from: http://www.mr4.org/AnophelesProgram/TrainingMethods.aspx 1725-1732 (2010).
- Tripet, F., et al. DNA analysis of transferred sperm reveals significant levels of gene flow between molecular forms of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 10, 1725-1732 (2001).
- Slotman, M. A. Evidence for subdivision within the M molecular form of Anopheles gambiae. Mol Ecol. 16, 639-649 (2007).
- Basu, P., et al. MassARRAY Spectrometry is More Sensitive Than PreTect HPV-Proofer and Consensus PCR for Type-Specific Detection of High-Risk Oncogenic HPV Genotypes in Cervical Cancer. J Clin Microbiol. , (2011).
- Fu, J. F. MassARRAY assay: a more accurate method for JAK2V617F mutation detection in Chinese patients with myeloproliferative disorders. Leukemia. 22, 660-663 (2008).
- Gabriel, S., Ziaugra, L., Tabbaa, D. SNP genotyping using the Sequenom MassARRAY iPLEX platform. Curr Protoc Hum Genet. 2 (Unit 2.12), (2009).
- Jurinke, C., van den Boom, D., Cantor, C. R., Koster, H. The use of MassARRAY technology for high throughput genotyping. Adv Biochem Eng Biotechnol. 77, 57-74 (2002).
- Wright, W. T. Multiplex MassARRAY spectrometry (iPLEX) produces a fast and economical test for 56 familial hypercholesterolaemia-causing mutations. Clin Genet. 74, 463-468 (2008).
- Turner, T. L., Hahn, M. W., Nuzhdin, S. V. Genomic islands of speciation in Anopheles gambiae. PLoS Biol. 3, e285 (2005).
- Turner, T. L., Hahn, M. W. Locus-population-specific selection and differentiation between incipient species of Anopheles gambiae. Mol Biol Evol. 24, 2132-2138 (2007).
- Stump, A. D. Centromere-proximal differentiation and speciation in Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 15930-15935 (2005).
- Lee, Y., Seifert, S. N., Fornadel, C. M., Norris, D. E., Lanzaro, G. C. Single-nucleotide polymorphisms for high-throughput genotyping of Anopheles arabiensis in East and southern Africa. J Med Entomol. 49, 307-315 (2012).
- Holt, R. A. The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae. Science. 298, 129-149 (2002).
- Lawniczak, M. K. Widespread divergence between incipient Anopheles gambiae species revealed by whole genome sequences. Science. 330, 512-514 (2010).
