La<em> En Ovo</em> Chick chorioallantoïque membrane (CAM) Assay comme un modèle de xénogreffe efficace de carcinome hépatocellulaire
Summary
The chick chorioallantoic membrane (CAM) is immunodeficient and highly vascularized, making it a natural in vivo model of tumor growth and angiogenesis. In this protocol, we describe a reliable method of growing three-dimensional, vascularized hepatocellular carcinoma (HCC) tumors using the CAM assay.
Abstract
La membrane chorioallantoïque poussin (CAM) commence à se développer au jour 7 après la fécondation et mûrit par jour 12. Le CAM est naturellement immunodéficientes et très vascularisée, ce qui en fait un système idéal pour l'implantation de la tumeur. En outre, la CAM contient des protéines de la matrice extracellulaire comme la fibronectine, la laminine, le collagène, l'intégrine alpha (v) beta3, et la MMP-2, ce qui en fait un modèle attractif pour étudier l'invasion tumorale et les métastases. Les scientifiques ont longtemps profité de la physiologie de la CAM en utilisant comme modèle de l'angiogenèse. Plus récemment, le dosage de la CAM a été modifié pour fonctionner comme un système in vivo de modèle de xénogreffe de différents cancers qui comble le fossé entre le travail de base in vitro et des modèles de cancer chez les animaux plus complexes. Le dosage CAM permet l'étude de la croissance tumorale, les thérapies anti-tumorales, et les voies moléculaires pro-tumorale dans un système biologiquement pertinent qui est à la fois en temps et en coût efficace. Ici, nous décrivons le développement de CAM Xenograft modèle de carcinome hépatocellulaire (HCC) avec le taux de survie embryonnaire de jusqu'à 93% et fiable take tumeur conduisant à la croissance de tumeurs vascularisées, en trois dimensions.
Introduction
Carcinome hépatocellulaire (CHC) est la 3 ème cause de mortalité par cancer dans le monde 1. Actuellement, seulement 30% des patients HCC sont admissibles à des traitements chirurgicaux potentiellement curatives 2, et la chimiothérapie systémique est pas efficace 3. Par conséquent, il ya un besoin urgent non satisfait clinique de nouvelles thérapies de HCC, et le développement de systèmes de modèles appropriés pour tester l'efficacité de nouveaux agents. Le dosage chorioallantoïque poussin membrane (CAM) offre une méthode à débit moyen rentable, rapide et reproductible de tester des médicaments potentiels anti-tumorales in vivo.
Le dosage de la CAM a été largement utilisée pour étudier l'angiogenèse 4. Il a également été développé avec succès dans un modèle de xénogreffe de tumeur de cancers, y compris un glioblastome 5, 6 cancer du pancréas, le mélanome 09/07, 11/10 et l'ostéosarcome. Les deux 12 in ovo et ex ovo13 techniques ont été utilisées dans la littérature, avec des détails variant de protocole pour le protocole. Un défi majeur pour le modèle de xénogreffe CAM est l'incidence relativement élevée de la mort de l'embryon après la manipulation de l'œuf, avec des taux de mortalité de l'embryon de poussin publiés allant de 25 à 50 pour cent 11-14.
Dans cet article, nous décrivons le développement d'un in ovo modèle de xénogreffe de CHC qui produit de manière fiable la croissance des trois dimensions, tumeurs vascularisées qui ressemblent histologiquement HCC indifférencié. Nous avons adapté un premier protocole décrit par Ossowski et al., 14 et avons réalisé chiches embryonnaire taux de jusqu'à 93% de survie à la greffe extrêmement élevé de la tumeur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Plusieurs étapes clés de ce protocole représentent la plus probable pour l'amélioration de la survie des embryons ainsi que la fiabilité accrue de la croissance tumorale. La chute du CAM loin de la coquille en appliquant une aspiration dans le sac d'air est moins invasive que les autres méthodes existantes (à l'aide d'une aiguille pour enlever l'albumine de l'œuf, dissection, etc.). En utilisant une punaise stérile pour créer les deux petits trous nécessaires à cette méthode est la p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.S. was partially supported by grants from the National Institutes of Health (NIH) National Institute of Dental and Craniofacial Research (5R03DE021741-02) and the National Cancer Institute (1K08CA154963-01A1).
The Howard Hughes Medical Institute provided funding for M.L. through the HHMI Medical Research Fellows Program.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Premium incubated eggs | Charles River | N/A | http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx |
| Egg incubators | GQF | Hova-Bator 2362N | |
| Rotating egg trays | GQF | 1611 Automatic Egg Turner | |
| Egg candler | Lyon | Hi-Power 950-070 | |
| Dremel 100 rotary tool with 15/16 cut-off wheel | Dremel | 100-N/7 | |
| Sterile forceps, push pin, dissection scissors, Scotch tape | |||
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Cryogenic vials, external thread with silicone washer | Corning | 430659 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C9891 |
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