<em> באוב</emAssay> אפרוח chorioallantoic ממברנה (CAM) כמודל xenograft יעיל של Hepatocellular Carcinoma
Summary
The chick chorioallantoic membrane (CAM) is immunodeficient and highly vascularized, making it a natural in vivo model of tumor growth and angiogenesis. In this protocol, we describe a reliable method of growing three-dimensional, vascularized hepatocellular carcinoma (HCC) tumors using the CAM assay.
Abstract
קרום החומוס chorioallantoic (רמ"א) מתחיל לפתח על ידי יום 7 לאחר הפריה ומתבגר ביום 12. CAM הוא באופן טבעי immunodeficient וכלי דם מאוד, מה שהופך את מערכת אידיאלית להשתלת גידול. יתר על כן, CAM מכיל חלבונים תאיים מטריצה כגון פיברונקטין, laminin, קולגן, אלפא integrin (נ) beta3, וMMP-2, מה שהופך את מודל אטרקטיבי ללמוד פלישת גידול וגרור. מדענים רבים ניצלו את הפיסיולוגיה של CAM על ידי שימוש בו כמודל של אנגיוגנזה. לאחרונה, assay CAM שונתה כדי לעבוד כמערכת in vivo xenograft מודל לסוגי סרטן שונים שמגשרת על הפער בין עבודה בסיסית במבחנה ודגמי סרטן בבעלי החיים מורכבים יותר. Assay CAM מאפשר לחקר צמיחת גידול, טיפולים אנטי-סרטניים, ומסלולים מולקולריים פרו-סרטניים במערכת רלוונטית מבחינה ביולוגית שהוא גם עלות וזמן יעיל. כאן, אנו מתארים את ההתפתחות של Xen CAMמודל ograft של קרצינומה hepatocellular (HCC) עם שיעורי הישרדות עובריים של עד 93% וגידול אמין לקחת מוביל לצמיחה של גידולים תלת-ממדיים, כלי דם.
Introduction
קרצינומה hepatocellular (HCC) הוא הגורם המוביל 3 בתמותה מהסרטן בעולם 1. כיום רק 30% מחולי HCC זכאים לטיפולים כירורגיים פוטנציאל מרפא 2, וכימותרפיה מערכתית אינה יעילה 3. לכן, יש צורך דחוף שלא סופקו קליני לטיפולי HCC רומן, והפיתוח של מערכות מודל מתאימות לבדיקות יעילים של סוכנים חדשים. Assay חומוס chorioallantoic קרום (CAM) מספק שיטה לשחזור, חסכונית, מהירה ובינונית תפוקה של בדיקת תרופות אנטי-סרטניים פוטנציאליות in vivo.
Assay CAM כבר נעשה שימוש נרחב ללמוד אנגיוגנזה 4. כמו כן פיתח בהצלחה למודל xenograft גידול של סרטן, כולל גליובלסטומה 5, סרטן לבלב 6, מלנומה 7-9, ואוסטאוסרקומה 10-11. שני באובו 12 ולשעבר אובו13 טכניקות כבר נוצלו בספרות, עם פרטים שונים מפרוטוקול לפרוטוקול. אחד אתגרים עיקריים למודל xenograft CAM הוא יחסית השכיחות הגבוהה של מוות עוברי לאחר המניפולציה של הביצה, עם שיעורי תמותה שפורסמו עובר אפרוח החל 25-50 אחוזים 11-14.
במאמר זה, אנו מתארים את הפיתוח של מודל באוב xenograft של HCC שמייצר באופן מהימן צמיחה של גידולים תלת-ממדיים, כלי דם שהיסטולוגית דומה HCC מובחן. יש לנו מותאם פרוטוקול שתואר לראשונה על ידי Ossowski et al. 14 והשיגו שיעורי הישרדות חומוס עוברי של עד 93% בקליטתם גידול גבוה מאוד.
Protocol
Representative Results
Discussion
כמה שלבים עיקריים בפרוטוקול זה סביר ביותר להסביר את ההישרדות העוברית המשופרת, כמו גם אמינות מוגברת של צמיחת גידול. הפלת CAM מהפגז על ידי יישום יניקה לצק האוויר היא פחות פולשני יותר משיטות קיימות אחרות (באמצעות מחט כדי להסיר אלבומין מהביצה, לנתיחה בוטה, וכו '). באמצעות …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.S. was partially supported by grants from the National Institutes of Health (NIH) National Institute of Dental and Craniofacial Research (5R03DE021741-02) and the National Cancer Institute (1K08CA154963-01A1).
The Howard Hughes Medical Institute provided funding for M.L. through the HHMI Medical Research Fellows Program.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Premium incubated eggs | Charles River | N/A | http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx |
| Egg incubators | GQF | Hova-Bator 2362N | |
| Rotating egg trays | GQF | 1611 Automatic Egg Turner | |
| Egg candler | Lyon | Hi-Power 950-070 | |
| Dremel 100 rotary tool with 15/16 cut-off wheel | Dremel | 100-N/7 | |
| Sterile forceps, push pin, dissection scissors, Scotch tape | |||
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Cryogenic vials, external thread with silicone washer | Corning | 430659 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C9891 |
References
- Sangiovanni, A., et al. Increased survival of cirrhotic patients with a hepatocellular carcinoma detected during surveillance. Gastroenterology. 126 (4), 1005-1014 (2004).
- Lopez, P. M., Villanueva, A., Llovet, J. M. Systematic review: evidence-based management of hepatocellular carcinoma–an updated analysis of randomized controlled trials. Aliment Pharmacol Ther. 23 (11), 1535-1547 (2006).
- Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 362 (9399), 1907-1917 (2003).
- Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent. J Natl Cancer Inst. 82, 4-6 (1990).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Dumartin, L., et al. Netrin-1 mediates early events in pancreatic adenocarcinoma progression, acting on tumor and endothelial cells. Gastroenterology. 138 (4), 1595-1606 (2010).
- Aguirre-Ghiso, J. A., Estrada, Y., Liu, D., Ossowski, L. ERK(MAPK) activity as a determinant of tumor growth and dormancy; regulation by p38(SAPK). Cancer Res. 63 (7), 1684-1695 (2003).
- Baroni, T. E., et al. Ribonomic and short hairpin RNA gene silencing methods to explore functional gene programs associated with tumor growth arrest. Methods Mol Biol. 383, 227-244 (2007).
- Lopez-Rivera, E., et al. Inducible nitric oxide synthase drives mTOR pathway activation and proliferation of human melanoma by reversible nitrosylation of TSC2. Cancer Res. 74 (4), 1067-1078 (2014).
- Balke, M., et al. A short-term in vivo model for giant cell tumor of bone. BMC Cancer. 11, 241 (2011).
- Balke, M., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Res Notes. 3, 58 (2010).
- Sys, G. M., et al. The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. J Vis Exp. (77), e50522 (2013).
- Dohle, D. S., et al. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J Vis Exp. (33), (2009).
- Ossowski, L., Reich, E. Experimental model for quantitative study of metastasis. Cancer Res. 40 (7), 2300-2309 (1980).
- Ghanekar, A., Ahmed, S., Chen, K., Adeyi, O. Endothelial cells do not arise from tumor-initiating cells in human hepatocellular carcinoma. BMC Cancer. 13, 485 (2013).
- Ho, J. W., et al. Effects of a novel immunomodulating agent, FTY720, on tumor growth and angiogenesis in hepatocellular carcinoma. Mol Cancer Ther. 4 (9), 1430-1438 (2005).
- Hagedorn, M., et al. VEGF coordinates interaction of pericytes and endothelial cells during vasculogenesis and experimental angiogenesis. Dev Dyn. 230 (1), 23-33 (2004).
