Il<em> In Ovo</em> Chick corioallantoidea membrana (CAM) Saggio come un efficiente dello xenotrapianto Modello di carcinoma epatocellulare
Summary
The chick chorioallantoic membrane (CAM) is immunodeficient and highly vascularized, making it a natural in vivo model of tumor growth and angiogenesis. In this protocol, we describe a reliable method of growing three-dimensional, vascularized hepatocellular carcinoma (HCC) tumors using the CAM assay.
Abstract
La membrana corioallantoidea pulcino (CAM) comincia a sviluppare il giorno 7 dopo la fecondazione e matura di giorno 12. Il CAM è naturalmente immunodeficienti e altamente vascolarizzato, che lo rendono un sistema ideale per tumore impianto. Inoltre, il CAM contiene proteine della matrice extracellulare, come fibronectina, laminina, collagene, integrina alfa (v) beta3, e MMP-2, che lo rendono un modello attraente per studiare invasione tumorale e metastasi. Gli scienziati hanno a lungo approfittato della fisiologia del CAM usandolo come modello di angiogenesi. Più di recente, il test CAM è stato modificato per lavorare come in vivo xenotrapianto sistema modello per vari tipi di cancro che colma il divario tra il lavoro di base in vitro e modelli di cancro animali più complessi. Il test permette CAM per lo studio della crescita tumorale, terapie anti-tumorali, e percorsi molecolari pro-tumorali in un sistema biologicamente rilevante che è sia in termini di costi e di tempo efficace. Qui, descriviamo lo sviluppo di Xen CAMModello ograft del carcinoma epatocellulare (HCC), con tassi di sopravvivenza embrionali fino al 93% e tumore affidabile take che porta alla crescita dei tumori vascolarizzati tridimensionali.
Introduction
Il carcinoma epatocellulare (HCC) è la 3 ° causa principale di mortalità per cancro nel mondo 1. Attualmente solo il 30% dei pazienti con carcinoma epatico sono ammissibili per i trattamenti chirurgici potenzialmente curative 2, e la chemioterapia sistemica non è efficace 3. Pertanto, vi è una pressante necessità clinica insoddisfatta di terapie HCC romanzo, e lo sviluppo di sistemi modello adatti efficiente sperimentazione di nuovi agenti. Il corioallantoidea test pulcino membrana (CAM) fornisce una riproducibilità, costo-efficacia, e veloce metodo di medio-throughput di testare potenziali farmaci antitumorali in vivo.
Il saggio CAM è stato ampiamente utilizzato per studiare l'angiogenesi 4. E 'stato anche sviluppato con successo in un modello di xenotrapianto di tumore di tumori, tra cui 5 glioblastoma, cancro al pancreas 6, il melanoma 7-9, e osteosarcoma 10-11. Sia in ovo 12 ed ex ovo13 tecniche sono state utilizzate in letteratura, con dettagli variano da protocollo protocollo. Una sfida importante per il modello CAM xenotrapianto è relativamente alta incidenza di morte embrionale dopo la manipolazione delle uova, con tassi di mortalità embrione di pulcino pubblicati vanno 25-50 per cento 11-14.
In questo articolo, si descrive lo sviluppo di un modello di xenotrapianto in ovo di HCC che produce in modo affidabile la crescita di tridimensionali, tumori vascolarizzati che istologicamente assomigliano HCC indifferenziata. Abbiamo adattato un protocollo prima descritto da Ossowski et al. 14 e abbiamo raggiunto pulcino embrionale tassi di sopravvivenza fino al 93% con altissima attecchimento del tumore.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diversi passaggi chiave di questo protocollo molto probabilmente rappresentano il miglioramento della sopravvivenza embrionale così come una maggiore affidabilità della crescita tumorale. Lasciando il CAM lontano dal serbatoio applicando aspirazione al sacco aereo è meno invasivo rispetto ad altri metodi esistenti (utilizzando un ago per rimuovere l'albumina dall'uovo, smussa, ecc). Utilizzando una puntina sterile per creare due piccoli fori necessari per questo metodo è la parte più impegnativa del protoco…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.S. was partially supported by grants from the National Institutes of Health (NIH) National Institute of Dental and Craniofacial Research (5R03DE021741-02) and the National Cancer Institute (1K08CA154963-01A1).
The Howard Hughes Medical Institute provided funding for M.L. through the HHMI Medical Research Fellows Program.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Premium incubated eggs | Charles River | N/A | http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx |
| Egg incubators | GQF | Hova-Bator 2362N | |
| Rotating egg trays | GQF | 1611 Automatic Egg Turner | |
| Egg candler | Lyon | Hi-Power 950-070 | |
| Dremel 100 rotary tool with 15/16 cut-off wheel | Dremel | 100-N/7 | |
| Sterile forceps, push pin, dissection scissors, Scotch tape | |||
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Cryogenic vials, external thread with silicone washer | Corning | 430659 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C9891 |
References
- Sangiovanni, A., et al. Increased survival of cirrhotic patients with a hepatocellular carcinoma detected during surveillance. Gastroenterology. 126 (4), 1005-1014 (2004).
- Lopez, P. M., Villanueva, A., Llovet, J. M. Systematic review: evidence-based management of hepatocellular carcinoma–an updated analysis of randomized controlled trials. Aliment Pharmacol Ther. 23 (11), 1535-1547 (2006).
- Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 362 (9399), 1907-1917 (2003).
- Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent. J Natl Cancer Inst. 82, 4-6 (1990).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Dumartin, L., et al. Netrin-1 mediates early events in pancreatic adenocarcinoma progression, acting on tumor and endothelial cells. Gastroenterology. 138 (4), 1595-1606 (2010).
- Aguirre-Ghiso, J. A., Estrada, Y., Liu, D., Ossowski, L. ERK(MAPK) activity as a determinant of tumor growth and dormancy; regulation by p38(SAPK). Cancer Res. 63 (7), 1684-1695 (2003).
- Baroni, T. E., et al. Ribonomic and short hairpin RNA gene silencing methods to explore functional gene programs associated with tumor growth arrest. Methods Mol Biol. 383, 227-244 (2007).
- Lopez-Rivera, E., et al. Inducible nitric oxide synthase drives mTOR pathway activation and proliferation of human melanoma by reversible nitrosylation of TSC2. Cancer Res. 74 (4), 1067-1078 (2014).
- Balke, M., et al. A short-term in vivo model for giant cell tumor of bone. BMC Cancer. 11, 241 (2011).
- Balke, M., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Res Notes. 3, 58 (2010).
- Sys, G. M., et al. The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. J Vis Exp. (77), e50522 (2013).
- Dohle, D. S., et al. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J Vis Exp. (33), (2009).
- Ossowski, L., Reich, E. Experimental model for quantitative study of metastasis. Cancer Res. 40 (7), 2300-2309 (1980).
- Ghanekar, A., Ahmed, S., Chen, K., Adeyi, O. Endothelial cells do not arise from tumor-initiating cells in human hepatocellular carcinoma. BMC Cancer. 13, 485 (2013).
- Ho, J. W., et al. Effects of a novel immunomodulating agent, FTY720, on tumor growth and angiogenesis in hepatocellular carcinoma. Mol Cancer Ther. 4 (9), 1430-1438 (2005).
- Hagedorn, M., et al. VEGF coordinates interaction of pericytes and endothelial cells during vasculogenesis and experimental angiogenesis. Dev Dyn. 230 (1), 23-33 (2004).
