Den<em> I Ovo</em> Kyllingechorioallantoinmembranen (CAM) Indhold som en effektiv xenograftmodel af hepatocellulært carcinom
Summary
The chick chorioallantoic membrane (CAM) is immunodeficient and highly vascularized, making it a natural in vivo model of tumor growth and angiogenesis. In this protocol, we describe a reliable method of growing three-dimensional, vascularized hepatocellular carcinoma (HCC) tumors using the CAM assay.
Abstract
Kyllingechorioallantoinmembranen (CAM) begynder at udvikle på dag 7 efter befrugtningen og modnes ved dag 12. CAM er naturligvis immundefekte og meget vaskulariseret, hvilket gør det til et ideelt system til tumorimplantation. Endvidere CAM indeholder ekstracellulære matrixproteiner, såsom fibronectin, laminin, collagen, alpha integrin (v) beta3 og MMP-2, hvilket gør det til en attraktiv model til at studere tumor invasion og metastase. Forskere har længe benyttet sig af fysiologi CAM ved at bruge det som en model af angiogenese. For nylig er CAM-assayet er modificeret til at fungere som en in vivo xenograft model for forskellige kræftformer, der bygger bro mellem grundforskning in vitro arbejde og mere komplekse dyrecancermodeller. CAM-assayet giver mulighed for undersøgelse af tumorvækst, antitumorbehandlinger, og pro-tumor molekylære veje i et biologisk relevant system, der er både omkostnings- og tidseffektiv. Her beskriver vi udviklingen af CAM Xenograft model af hepatocellulært carcinom (HCC) med embryonale overlevelsesrater på op til 93% og pålidelig tumor tage fører til vækst af tre-dimensionelle, vaskulariserede tumorer.
Introduction
Hepatocellulært carcinom (HCC) er den 3. hyppigste årsag til kræft dødsfald i verden 1. I øjeblikket kun 30% af HCC patienter er berettiget til potentielt helbredende kirurgiske behandlinger 2, og systemisk kemoterapi ikke er effektiv 3. Derfor er der et presserende udækket behandlingsbehov for nye HCC terapier, og udvikling af modelsystemer er egnet til effektiv afprøvning af nye midler. Kyllingechorioallantoinmembranen (CAM) assay tilvejebringer en reproducerbar, omkostningseffektiv og hurtig medium-throughput metode til afprøvning af potentielle anti-tumor lægemidler in vivo.
CAM-assayet er blevet anvendt i vid udstrækning til at studere angiogenese 4. Det er også blevet udviklet med succes i en tumor xenograft model af cancere, herunder glioblastom 5, pancreascancer 6, melanom 7-9 og osteosarkom 10-11. Både in ovo 12 og ex ovo13 teknikker er blevet anvendt i litteraturen, med detaljer varierende fra protokol til protokol. En væsentlig udfordring for CAM xenograftmodel er den relativt høje forekomst af embryonale død efter manipulation af ægget, med offentliggjorte chick dødelighed embryo spænder fra 25 til 50 procent 11-14.
I denne artikel beskriver vi udviklingen af en in ovo xenograft model af HCC, som pålideligt producerer vækst på tre-dimensionelle, vaskulariserede tumorer, der histologisk ligner udifferentieret HCC. Vi har tilpasset en protokol først beskrevet af Ossowski et al. 14 og har opnået chick embryonale overlevelsesrater på op til 93% med ekstremt høj tumor transplantation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flere vigtige skridt i denne protokol sandsynligvis tegner sig for den forbedrede embryonale overlevelse samt øget pålidelighed af tumorvækst. Droppe CAM væk fra skallen ved at påføre sugning til luftsækken er mindre invasiv end andre eksisterende metoder (anvendelse af en nål til at fjerne albumin fra ægget, stump dissektion, etc.). Ved hjælp af en steril skub pin til at skabe de to små huller, der er nødvendige for denne metode er den mest udfordrende del af protokollen. Bruger for meget kraft kan resulter…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.S. was partially supported by grants from the National Institutes of Health (NIH) National Institute of Dental and Craniofacial Research (5R03DE021741-02) and the National Cancer Institute (1K08CA154963-01A1).
The Howard Hughes Medical Institute provided funding for M.L. through the HHMI Medical Research Fellows Program.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Premium incubated eggs | Charles River | N/A | http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx |
| Egg incubators | GQF | Hova-Bator 2362N | |
| Rotating egg trays | GQF | 1611 Automatic Egg Turner | |
| Egg candler | Lyon | Hi-Power 950-070 | |
| Dremel 100 rotary tool with 15/16 cut-off wheel | Dremel | 100-N/7 | |
| Sterile forceps, push pin, dissection scissors, Scotch tape | |||
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Cryogenic vials, external thread with silicone washer | Corning | 430659 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C9891 |
References
- Sangiovanni, A., et al. Increased survival of cirrhotic patients with a hepatocellular carcinoma detected during surveillance. Gastroenterology. 126 (4), 1005-1014 (2004).
- Lopez, P. M., Villanueva, A., Llovet, J. M. Systematic review: evidence-based management of hepatocellular carcinoma–an updated analysis of randomized controlled trials. Aliment Pharmacol Ther. 23 (11), 1535-1547 (2006).
- Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 362 (9399), 1907-1917 (2003).
- Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent. J Natl Cancer Inst. 82, 4-6 (1990).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Dumartin, L., et al. Netrin-1 mediates early events in pancreatic adenocarcinoma progression, acting on tumor and endothelial cells. Gastroenterology. 138 (4), 1595-1606 (2010).
- Aguirre-Ghiso, J. A., Estrada, Y., Liu, D., Ossowski, L. ERK(MAPK) activity as a determinant of tumor growth and dormancy; regulation by p38(SAPK). Cancer Res. 63 (7), 1684-1695 (2003).
- Baroni, T. E., et al. Ribonomic and short hairpin RNA gene silencing methods to explore functional gene programs associated with tumor growth arrest. Methods Mol Biol. 383, 227-244 (2007).
- Lopez-Rivera, E., et al. Inducible nitric oxide synthase drives mTOR pathway activation and proliferation of human melanoma by reversible nitrosylation of TSC2. Cancer Res. 74 (4), 1067-1078 (2014).
- Balke, M., et al. A short-term in vivo model for giant cell tumor of bone. BMC Cancer. 11, 241 (2011).
- Balke, M., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Res Notes. 3, 58 (2010).
- Sys, G. M., et al. The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. J Vis Exp. (77), e50522 (2013).
- Dohle, D. S., et al. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J Vis Exp. (33), (2009).
- Ossowski, L., Reich, E. Experimental model for quantitative study of metastasis. Cancer Res. 40 (7), 2300-2309 (1980).
- Ghanekar, A., Ahmed, S., Chen, K., Adeyi, O. Endothelial cells do not arise from tumor-initiating cells in human hepatocellular carcinoma. BMC Cancer. 13, 485 (2013).
- Ho, J. W., et al. Effects of a novel immunomodulating agent, FTY720, on tumor growth and angiogenesis in hepatocellular carcinoma. Mol Cancer Ther. 4 (9), 1430-1438 (2005).
- Hagedorn, M., et al. VEGF coordinates interaction of pericytes and endothelial cells during vasculogenesis and experimental angiogenesis. Dev Dyn. 230 (1), 23-33 (2004).
