Den<em> I Ovo</em> Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) analyse som en effektiv Xenotransplantat Modell av leverkreft

Summary

The chick chorioallantoic membrane (CAM) is immunodeficient and highly vascularized, making it a natural in vivo model of tumor growth and angiogenesis. In this protocol, we describe a reliable method of growing three-dimensional, vascularized hepatocellular carcinoma (HCC) tumors using the CAM assay.

Abstract

Dama chorioallantoic membran (CAM) begynner å utvikle seg etter dag 7 etter befruktning og modnes etter dag 12. CAM er naturlig immunodeficient og svært vascularized, noe som gjør det til et ideelt system for tumorimplantering. Videre inneholder CAM ekstracellulære matriseproteiner slik som fibronectin, laminin, kollagen, integrin alpha (v) beta3, og MMP-2, noe som gjør den til en attraktiv modell for å studere tumorinvasjon og metastase. Forskere har lenge benyttet seg av fysiologi av CAM ved å bruke det som en modell av angiogenese. Mer nylig har CAM-testen blitt modifisert for å virke som en in vivo-xenograft modellsystem for ulike kreftformer som bygger bro mellom grunn in vitro arbeid og mer komplekse dyrekreftmodeller. CAM-testen gjør det mulig for studiet av tumorvekst, anti-tumor terapi, og pro-tumor molekylære reaksjonsveier i et biologisk relevant system som er både kostnads- og tidseffektiv. Her beskriver vi utviklingen av CAM Xenograft modell av leverkreft (HCC) med embryonale overlevelse på opp til 93% og pålitelig svulst tar fører til vekst av tredimensjonale, vaskulariserte svulster.

Introduction

Leverkreft (HCC) er den ^3. største årsaken til kreftdødelighet i verden ^en. Foreløpig bare 30% av HCC pasienter er kvalifisert for potensielt kurativ kirurgisk behandling ^2, og systemisk kjemoterapi er ikke effektiv ^tre. Derfor er det et presser udekket klinisk behov for nye terapier HCC, og utvikling av modellsystemer som er egnet for effektiv testing av nye midler. Dama chorioallantoic membran (CAM) assay tilveiebringer en reproduserbar, kostnadseffektiv, og rask medium-throughput fremgangsmåte for å teste potensielle anti-tumor medikamenter in vivo.

CAM-testen har blitt brukt mye til å studere angiogenese ^4. Det har også blitt utviklet til en tumor xenograft modell av kreft, inkludert glioblastom ^{5, 6} bukspyttkjertelkreft, melanom ^7-9, og osteosarkom ^10-11. Både i ovo ^{12 og} ex ovo¹³ teknikker har blitt anvendt i litteraturen, med detaljer som varierer fra protokollen til protokollen. En stor utfordring for CAM xenotransplantat modellen er den relativt høye forekomsten av embryonale død etter manipulasjon av egg, med publiserte chick dødelighets embryo priser som spenner 25-50 prosent ^11-14.

I denne artikkelen beskriver vi å utvikle en in ovo xenograft modell av HCC som på en pålitelig måte frembringer vekst av tredimensjonale, vaskulariserte tumorer som histologisk ligner udifferensiert HCC. Vi har tilpasset en protokoll først beskrevet av Ossowski et al ^14. Og har oppnådd chick embryonale overlevelse på opp til 93% med ekstremt høy tumor engraftment.

Protocol

1. Egg Inkubasjon Skaff 8 dager gamle patogenfrie embryon egg. Plasser egg i roterende egg skuff, stemplet ender vendt oppover, og plasser den roterende skuffen inni et egg inkubator. Inkuber egg i 48 timer ved 36 ° C og 50% luftfuktighet. 2. Slippe CAM og Åpne Eggs Samle egg fra inkubator. Plasser egg i egget rack, stemplet siden opp og bringe til laminær hette. Slå av rommet og hette lys. Hold i stemplet enden av egget forsiktig…

Representative Results

Representative bilder av viktige trinnene i protokollen er vist her. Figur 1A viser bruken av den Candler å visualisere utviklingen av embryo, luftsekken, og vaskulaturen av CAM. Figur 1B-1C viser prosessen med å slippe CAM ved å gjøre de to hull og deretter påføring av negativt trykk ved hjelp av sikkerhets pære, og Figur 1D viser et vellykket falt CAM med en stor luftboble under blyant-merket hullet. Figur 1E og Figur 1F viser …

Discussion

Flere viktige skritt i denne protokollen mest sannsynlig står for den forbedrede embryonale overlevelse samt økt pålitelighet av tumorvekst. CAM slippe vekk fra skallet ved å påføre sugekraft til luftsekken er mindre inngrep enn andre eksisterende metoder (ved hjelp av en nål for å fjerne albumin fra egget, stump disseksjon, etc.). Ved hjelp av en steril nål for å skape trykk de to små hull som kreves for denne metoden er den mest krevende delen av protokollen. Bruke for mye kraft kan føre til skade på CAM …

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Premium incubated eggs	Charles River	N/A	http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx
Egg incubators	GQF	Hova-Bator 2362N
Rotating egg trays	GQF	1611 Automatic Egg Turner
Egg candler	Lyon	Hi-Power 950-070
Dremel 100 rotary tool with 15/16 cut-off wheel	Dremel	100-N/7
Sterile forceps, push pin, dissection scissors, Scotch tape
Matrigel	BD Biosciences	356234
Cryogenic vials, external thread with silicone washer	Corning	430659
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma	C9891