Den<em> In ovo</em> Chick korioallantoinmembranet (CAM) analys som en effektiv xenotransplantatmodell för Hepatocellulär cancer
Summary
The chick chorioallantoic membrane (CAM) is immunodeficient and highly vascularized, making it a natural in vivo model of tumor growth and angiogenesis. In this protocol, we describe a reliable method of growing three-dimensional, vascularized hepatocellular carcinoma (HCC) tumors using the CAM assay.
Abstract
Chick korioallantoinmembranet (CAM) börjar att utvecklas genom dag 7 efter befruktning och mognar dag 12. CAM är naturligt immunbrist och högt vaskulariserad, vilket gör det till ett idealiskt system för tumörimplantation. Vidare CAM innehåller extracellulära matrisproteiner såsom fibronektin, laminin, kollagen, integrin alfa (v) beta3, och MMP-2, vilket gör det till en attraktiv modell för att studera tumörinvasion och metastas. Forskare har länge utnyttjat fysiologi CAM genom att använda det som en modell av angiogenes. På senare tid har CAM-analysen ändrats för att fungera som en in vivo xenograft modellsystem för olika typer av cancer som överbryggar gapet mellan grundforskning in vitro arbete och mer komplexa djur cancermodeller. CAM-analysen möjliggör studier av tumörtillväxt, antitumörläkemedel, och pro-tumör molekylära vägar i ett biologiskt relevant system som är både kostnads- och tidseffektiv. Här beskriver vi utvecklingen av CAM xenograft modell av hepatocellulär cancer (HCC) med embryonala överlevnad på upp till 93% och tillförlitlig tumör tar leder till tillväxt av tredimensionella, vaskulariserade tumörer.
Introduction
Hepatocellulär cancer (HCC) är den 3: e största orsaken till cancerdödlighet i världen 1. För närvarande endast 30% av HCC patienter är berättigade till potentiellt läkande kirurgiska behandlingar 2 och systemisk kemoterapi inte är effektiv 3. Därför finns det ett trängande ouppfyllt kliniskt behov av nya HCC terapier, och utveckling av modellsystem som lämpar sig för effektiv testning av nya agenter. Chick korioallantoinmembranet (CAM) analysen möjliggör reproducerbar, kostnadseffektiv, och snabb medel genomströmning metod för att testa potentiella antitumörläkemedel in vivo.
CAM-analysen har använts i stor utsträckning för att studera angiogenes 4. Det har också framgångsrikt utvecklats till en tumör xenograft modell av cancer, inklusive glioblastom 5, pankreascancer 6, melanom 7-9, och osteosarkom 10-11. Både in ovo 12 och ex ovo13 tekniker har använts i litteraturen, med detaljer varierar från protokoll till protokollet. En stor utmaning till CAM xenotransplantatmodell är den relativt höga förekomsten av embryonal död efter manipulering av ägget, med publicerade chick embryodödlighet som sträcker sig från 25 – 50 procent 11 till 14.
I den här artikeln beskriver vi utvecklingen av en in ovo xenotransplantatmodell av HCC som tillförlitligt producerar tillväxten av tredimensionella, vaskulariserade tumörer som histologiskt liknar odifferentierade HCC. Vi har anpassat ett protokoll som först beskrivits av Ossowski et al. 14 och har uppnått chick embryonala överlevnadsnivåer på upp till 93% med extremt hög tumör engraftment.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flera viktiga steg i detta protokoll svarar troligen för förbättrad överlevnad av embryo samt ökad tillförlitlighet av tumörtillväxt. Tappa CAM bort från skalet genom att applicera sug till luftsäcken är mindre invasiv än andra befintliga metoder (med hjälp av en nål för att ta bort albumin från ägget, dissektion, etc.). Med hjälp av en steril Markeringen visar att skapa de två små hål som krävs för denna metod är den mest utmanande delen av protokollet. Använda för mycket kraft kan leda till s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.S. was partially supported by grants from the National Institutes of Health (NIH) National Institute of Dental and Craniofacial Research (5R03DE021741-02) and the National Cancer Institute (1K08CA154963-01A1).
The Howard Hughes Medical Institute provided funding for M.L. through the HHMI Medical Research Fellows Program.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Premium incubated eggs | Charles River | N/A | http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx |
| Egg incubators | GQF | Hova-Bator 2362N | |
| Rotating egg trays | GQF | 1611 Automatic Egg Turner | |
| Egg candler | Lyon | Hi-Power 950-070 | |
| Dremel 100 rotary tool with 15/16 cut-off wheel | Dremel | 100-N/7 | |
| Sterile forceps, push pin, dissection scissors, Scotch tape | |||
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Cryogenic vials, external thread with silicone washer | Corning | 430659 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C9891 |
References
- Sangiovanni, A., et al. Increased survival of cirrhotic patients with a hepatocellular carcinoma detected during surveillance. Gastroenterology. 126 (4), 1005-1014 (2004).
- Lopez, P. M., Villanueva, A., Llovet, J. M. Systematic review: evidence-based management of hepatocellular carcinoma–an updated analysis of randomized controlled trials. Aliment Pharmacol Ther. 23 (11), 1535-1547 (2006).
- Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 362 (9399), 1907-1917 (2003).
- Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent. J Natl Cancer Inst. 82, 4-6 (1990).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Dumartin, L., et al. Netrin-1 mediates early events in pancreatic adenocarcinoma progression, acting on tumor and endothelial cells. Gastroenterology. 138 (4), 1595-1606 (2010).
- Aguirre-Ghiso, J. A., Estrada, Y., Liu, D., Ossowski, L. ERK(MAPK) activity as a determinant of tumor growth and dormancy; regulation by p38(SAPK). Cancer Res. 63 (7), 1684-1695 (2003).
- Baroni, T. E., et al. Ribonomic and short hairpin RNA gene silencing methods to explore functional gene programs associated with tumor growth arrest. Methods Mol Biol. 383, 227-244 (2007).
- Lopez-Rivera, E., et al. Inducible nitric oxide synthase drives mTOR pathway activation and proliferation of human melanoma by reversible nitrosylation of TSC2. Cancer Res. 74 (4), 1067-1078 (2014).
- Balke, M., et al. A short-term in vivo model for giant cell tumor of bone. BMC Cancer. 11, 241 (2011).
- Balke, M., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Res Notes. 3, 58 (2010).
- Sys, G. M., et al. The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. J Vis Exp. (77), e50522 (2013).
- Dohle, D. S., et al. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J Vis Exp. (33), (2009).
- Ossowski, L., Reich, E. Experimental model for quantitative study of metastasis. Cancer Res. 40 (7), 2300-2309 (1980).
- Ghanekar, A., Ahmed, S., Chen, K., Adeyi, O. Endothelial cells do not arise from tumor-initiating cells in human hepatocellular carcinoma. BMC Cancer. 13, 485 (2013).
- Ho, J. W., et al. Effects of a novel immunomodulating agent, FTY720, on tumor growth and angiogenesis in hepatocellular carcinoma. Mol Cancer Ther. 4 (9), 1430-1438 (2005).
- Hagedorn, M., et al. VEGF coordinates interaction of pericytes and endothelial cells during vasculogenesis and experimental angiogenesis. Dev Dyn. 230 (1), 23-33 (2004).
