ال<em> في البيضة</em> الفرخ مشيمائي غشاء (CAM) الفحص بمثابة طعم أجنبي نموذج فعال لسرطان الكبد
Summary
The chick chorioallantoic membrane (CAM) is immunodeficient and highly vascularized, making it a natural in vivo model of tumor growth and angiogenesis. In this protocol, we describe a reliable method of growing three-dimensional, vascularized hepatocellular carcinoma (HCC) tumors using the CAM assay.
Abstract
غشاء مشيمائي الفرخ (CAM) يبدأ في تطوير بعد يوم 7 بعد الإخصاب وينضج بعد يوم 12. وCAM هو العوز المناعي بشكل طبيعي وأوعية دموية للغاية، مما يجعله نظام مثالي للورم زرع. علاوة على ذلك، CAM يحتوي على البروتينات المصفوفة خارج الخلية مثل فبرونيكتين، laminin، الكولاجين، إنتغرين ألفا (V) beta3، وMMP-2، مما يجعلها نموذجا جذابا لدراسة غزو الورم والانبثاث. وقد أخذ العلماء منذ فترة طويلة الاستفادة من علم وظائف الأعضاء من CAM عن طريق استخدامه كنموذج من الأوعية الدموية. وفي الآونة الأخيرة، تم تعديل مقايسة CAM في العمل بوصفه في الجسم الحي طعم أجنبي نظام نموذجي لمختلف أنواع السرطان الذي يسد الفجوة بين العمل الأساسي في المختبر ونماذج سرطان الحيوانات أكثر تعقيدا. مقايسة CAM يسمح لدراسة نمو الورم، والعلاجات المضادة للورم، والمؤيدة للورم المسارات الجزيئية في نظام بيولوجيا في آن معا من حيث التكلفة وفعالة في الوقت المحدد. هنا، نحن تصف تطوير CAM كسيننموذج ograft من سرطان الخلايا الكبدية (HCC) مع معدلات البقاء على قيد الحياة الجنينية لمدة تصل إلى 93٪ والورم موثوق تأخذ يؤدي إلى نمو ثلاثية الأبعاد، وأورام أوعية دموية.
Introduction
سرطان الخلايا الكبدية (HCC) هو السبب الرئيسي الثالث 3 وفيات السرطان في العالم 1. حاليا 30٪ فقط من المرضى HCC مؤهلة للحصول على العلاجات الجراحية يحتمل العلاجية 2، والعلاج الكيميائي النظامية ليس فعال 3. ولذلك، هناك حاجة ملحة السريرية غير الملباة لعلاجات HCC جديدة، وتطوير نظم نموذج مناسبة لاختبار كفاءة وكلاء الجديد. يوفر فرخ مشيمائي غشاء (CAM) فحص واستنساخه وفعالة من حيث التكلفة، وسريع طريقة متوسطة مرت من اختبار العقاقير المحتملة المضادة للورم في الجسم الحي.
وقد استخدمت مقايسة CAM على نطاق واسع لدراسة الأوعية الدموية 4. كما تم وضع بنجاح في نموذج طعم أجنبي الورم من السرطانات، بما في ذلك ورم أرومي 5، 6 سرطان البنكرياس، سرطان الجلد 7-9، وعظمية 10-11. سواء في البيضة والبيضة السابقين 12وقد تم استخدام 13 تقنيات في الأدب، مع تفاصيل متفاوتة من بروتوكول للبروتوكول. واحد تحديا كبيرا للنموذج CAM طعم أجنبي هو معدلات عالية نسبيا من وفاة الجنين بعد التلاعب في البيض، مع نشر معدلات وفيات الأجنة الفرخ تتراوح 25-50 في المئة 11-14.
في هذه المقالة، نحن تصف وضع البيضة في نموذج طعم أجنبي من سرطان الكبد الذي ينتج موثوق نمو ثلاثية الأبعاد، وأورام أوعية دموية تشبه تشريحيا HCC غير متمايزة. تكيفنا بروتوكول وصف لأول مرة من قبل Ossowski وآخرون. 14 وحققت الفرخ الجنينية معدلات البقاء على قيد الحياة لمدة تصل إلى 93٪ مع ارتفاع للغاية engraftment الورم.
Protocol
Representative Results
Discussion
العديد من الخطوات الرئيسية في هذا البروتوكول على الأرجح حساب لتحسين البقاء على قيد الحياة الجنينية، وكذلك زيادة موثوقية نمو الورم. اسقاط CAM بعيدا عن قذيفة من خلال تطبيق الشفط لكيس الهواء هو أقل الغازية من الطرق الأخرى القائمة (باستخدام إبرة لإزالة الزلال من البيضة، ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.S. was partially supported by grants from the National Institutes of Health (NIH) National Institute of Dental and Craniofacial Research (5R03DE021741-02) and the National Cancer Institute (1K08CA154963-01A1).
The Howard Hughes Medical Institute provided funding for M.L. through the HHMI Medical Research Fellows Program.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Premium incubated eggs | Charles River | N/A | http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx |
| Egg incubators | GQF | Hova-Bator 2362N | |
| Rotating egg trays | GQF | 1611 Automatic Egg Turner | |
| Egg candler | Lyon | Hi-Power 950-070 | |
| Dremel 100 rotary tool with 15/16 cut-off wheel | Dremel | 100-N/7 | |
| Sterile forceps, push pin, dissection scissors, Scotch tape | |||
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Cryogenic vials, external thread with silicone washer | Corning | 430659 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C9891 |
References
- Sangiovanni, A., et al. Increased survival of cirrhotic patients with a hepatocellular carcinoma detected during surveillance. Gastroenterology. 126 (4), 1005-1014 (2004).
- Lopez, P. M., Villanueva, A., Llovet, J. M. Systematic review: evidence-based management of hepatocellular carcinoma–an updated analysis of randomized controlled trials. Aliment Pharmacol Ther. 23 (11), 1535-1547 (2006).
- Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 362 (9399), 1907-1917 (2003).
- Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent. J Natl Cancer Inst. 82, 4-6 (1990).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Dumartin, L., et al. Netrin-1 mediates early events in pancreatic adenocarcinoma progression, acting on tumor and endothelial cells. Gastroenterology. 138 (4), 1595-1606 (2010).
- Aguirre-Ghiso, J. A., Estrada, Y., Liu, D., Ossowski, L. ERK(MAPK) activity as a determinant of tumor growth and dormancy; regulation by p38(SAPK). Cancer Res. 63 (7), 1684-1695 (2003).
- Baroni, T. E., et al. Ribonomic and short hairpin RNA gene silencing methods to explore functional gene programs associated with tumor growth arrest. Methods Mol Biol. 383, 227-244 (2007).
- Lopez-Rivera, E., et al. Inducible nitric oxide synthase drives mTOR pathway activation and proliferation of human melanoma by reversible nitrosylation of TSC2. Cancer Res. 74 (4), 1067-1078 (2014).
- Balke, M., et al. A short-term in vivo model for giant cell tumor of bone. BMC Cancer. 11, 241 (2011).
- Balke, M., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Res Notes. 3, 58 (2010).
- Sys, G. M., et al. The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. J Vis Exp. (77), e50522 (2013).
- Dohle, D. S., et al. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J Vis Exp. (33), (2009).
- Ossowski, L., Reich, E. Experimental model for quantitative study of metastasis. Cancer Res. 40 (7), 2300-2309 (1980).
- Ghanekar, A., Ahmed, S., Chen, K., Adeyi, O. Endothelial cells do not arise from tumor-initiating cells in human hepatocellular carcinoma. BMC Cancer. 13, 485 (2013).
- Ho, J. W., et al. Effects of a novel immunomodulating agent, FTY720, on tumor growth and angiogenesis in hepatocellular carcinoma. Mol Cancer Ther. 4 (9), 1430-1438 (2005).
- Hagedorn, M., et al. VEGF coordinates interaction of pericytes and endothelial cells during vasculogenesis and experimental angiogenesis. Dev Dyn. 230 (1), 23-33 (2004).
