En<em> Ex vivo</em> Model til Uddannelse hormonvirkning i Human Breast
Summary
Vi har udviklet en ny ex vivo-model til at studere hormon indsats i human bryst. Den er baseret på væv mikrostrukturer isoleret fra kirurgisk bryst vævsprøver, som bevarer væv arkitektur, intercellulære interaktioner, og parakrin signalering.
Abstract
Studiet af hormonvirkning i humane bryst- er blevet hæmmet af manglende passende modelsystemer. Ved in vitro kultur, primære mammaepitelceller tendens til at miste hormon receptor ekspression. Udbredte hormon receptor positiv brystkræft cellelinier er af begrænset relevans for in vivo situation. Her beskriver vi en ex vivo model til at studere hormon indsats i human bryst. Friske humane bryst vævsprøver fra kirurgisk udsmid materiale såsom mammoplasties eller mammectomies reduktion er mekanisk og enzymatisk fordøjet at opnå vævsfragmenter indeholder kanaler og lobules og flere stromale celletyper. Disse væv mikrostrukturer holdes i basalt medium uden vækstfaktorer bevare deres intercellulære kontakter, vævet arkitektur, og forblive hormon lydhør i flere dage. De er let behandles til RNA og protein ekstraktion, histologisk analyse eller opbevares i frysemedium. Fluorescenscellesortering (FACS) kan anvendes til at berige for specifikke cellepopulationer. Denne protokol giver en ligefrem, standard metode til translationelle studier med meget komplekse, varierede humane prøver.
Introduction
Oplysninger om den mutational landskab i brystkræft er stigende på hurtigt tempo. Mindre opmærksomhed er blevet betalt til systemiske faktorer, der påvirker brystkræft udvikling. Udsættelse for reproduktive hormoner har stor indflydelse på sygdomsudvikling 1-3. Alligevel er de mekanismer, som reproduktive hormoner kolliderer med menneskelige bryst dårligt forstået. Arbejde med gensplejsede musemodeller har vist, at de involverer celle iboende og parakrin signalering gennem flere nedstrømseffektorer 4.
Den begrænsede viden om hormon handling i den menneskelige bryst skyldes i høj grad mangel på hensigtsmæssige modeller. Meste arbejde om mekanismerne af østrogen-receptor (ER) og progesteron-receptor (PR) signalering er blevet udført med hormonreceptor positive brystkræft cellelinier, såsom MCF-7 og T47D. Disse blev afledt af pleuraekssudat fra patienter med fremskreden brystcancer, som havde already fik flere behandlinger 5. Den biologiske relevans af resultaterne i sådanne enkle in vitro modeller af den menneskelige bryst er tvivlsomme og målgener identificeret i disse in vitro modeller er forskellige fra målgener, der er identificeret i dyremodeller 6. Når primære humane bryst epiteliale celler dyrkes in vitro de tendens til at miste hormon receptor-ekspression og dermed hormon respons 7,8. Dette problem kan circumventd af avancerede 3D-metoder, der anvender matrigel. På denne måde lykkedes C. Clarke og kolleger oprettelse bryst epiteliale celler, opretholdt hormon receptor-ekspression og viste en proliferativ reaktion på progesteron stimulation 9. Men to vigtige in vivo progesteron receptor målgener, Wnt-4 og RANKL, blev ikke induceret ved progesteron stimulation i dette system 9. Denne fremgangsmåde blev for nylig taget på videre med in vitro </em> hormon forbehandling og RANKL induktion blev opnået 10. En advarsel er, at matrigel har aktiviteter, der er batch-afhængig, er dyre, og kræver et eksperimentelt design, der er velegnet til små celle kun tal.
Baseret på den konstatering, at in vivo-ER og PR-signalering er i høj grad medieret af parakrine interaktioner 11, fremførte vi, at der skal opretholdes intercellulære interaktioner. En anden vigtig faktor, der er tabt som væv dissocieret til enkelte celler til in vitro kultur vekselvirkninger epitelceller med den ekstracellulære matrix; endnu disse er kritiske for epitel differentiering og deres forstyrrelser er vigtig i tumorgenese 12. Med dette i tankerne, vi etableret en metode til at isolere bryst væv mikrostrukturer fra frisk kirurgisk udsmid materiale 13. Bryst parenkym Den består af en to-lags epitel med indvendig luminale og ydre myoepitheliAL-celler, dissekeres væk fra fedtvæv og udsættes for mekanisk og enzymatisk dissociation. Efter vask og centrifugering, er fragmenter af mælkekanaler opnået som bevarer nære interaktioner med mange stromaceller. Disse væv mikrostrukturer forblive hormon lydhør. Modellen blev valideret i kliniske prøver 13. Som sådan kan den nuværende procedure med til at studere hormonvirkning i brystet i en biologisk og klinisk relevant sammenhæng.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den ex vivo kultur beskrevet her tilvejebringer brystvæv mikrostrukturer indeholdende intakte kanaler og lobules, sammen med andre celletyper, der normalt findes i den humane kvindelige bryst. I behandlingen af brystvæv menneske normalt fra reduktion mammoplasties, fjernelse af fedtvæv, mekanisk og enzymatisk fordøjelse af stromale matrix, og lyse af røde blodlegemer beriger for mælk ventilationskanal fragmenter og terminale duktale luftrør enheder. Gentle enzymatisk nedbrydning på det rigtige kon…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker M. Fiche af University Hospital of Lausanne for at give mammoplasty fotografi, M. Wirth og A. Ayyanan af Swiss Institute for Experimental Cancer Research, Det Nationale Center for Kompetence i forskning Molecular Oncology, School of Life Sciences, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne til faglig bistand og R. Clarke fra University of Manchester til kritiske bemærkninger. Den forskning, der fører til disse resultater har fået støtte fra SNF3100A0-112090, Oncosuisse 531.817, og initiativet om innovative lægemidler fællesforetagende i henhold tilskudsaftale nej. 115.188, ressourcer der består af finansielle bidrag fra Den Europæiske Unions syvende rammeprogram (FP7 / 2007-2013) og European Federation of Pharmaceutical Industries og foreninger virksomheder «i naturalier bidrag. Webadressen på initiativet om innovative lægemidler er http://www.imi.europa.eu/ . </ P>
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Microlitre Centrifuge | Heraeus Biofuge Fresco | 75005521 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5810 000.327 | |
| Cryobox | Nalgene | 5100-0001 | |
| Controlled Rate Freezer EF600 Grant | Asymptote | EF600 | |
| CO2 incubator | Hera Cell Heraeus | 51022391 | |
| Roller Mixer SRT9D | Sturt | SRT9D | |
| Histology Cassettes | Medizintechnik | 81-0021-00 | |
| Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| Strile Surgical Blade | Aesculap | BB536 | |
| Scalpel | Aesculap | BB084R | |
| Forceps | Aesculap | BD047R | |
| Scissors | Aesculap | BC374R | |
| Paraffin base mold | SAKURA | 4166 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Cryomatrix | Thermoscientific | 6769006 | Fetal Bovine Serum |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| Antibiotic/Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| DMEM F/12 | Life Technologies | 11039-021 | Prewarm (37°C) |
| Collagenase | Roche | 11 088 793 001 | Prewarm (37°C) |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270 | Can be replaced with Fetal Calf Serum |
| Cell Blood Lysis Buffer | Sigma | R7757 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| Paraformaldehyde | Roth | 335 | |
| Isopentane | Sigma | M32631 | |
| Ethanol | Merck | 1009831000 | |
| Cryogenic vials (5.0ml) | VWR, International | 479-0820 | |
| Ultra low attachment culture dish | Corning, NY 14831 | 3471 |
References
- Beral, V. Breast cancer and hormone-replacement therapy in the Million Women Study. Lancet. 362 (9382), 419-427 (2003).
- MacMahon, B., et al. Age at first birth and breast cancer risk. Bull World Health Organ. 43 (2), 209-221 (1970).
- Pike, M. C., Krailo, M. D., Henderson, B. E., Casagrande, J. T., Hoel, D. G. ‘Hormonal’ risk factors, ‘breast tissue age’ and the age-incidence of breast cancer. Nature. 303 (5920), 767-770 (1983).
- Brisken, C., O’Malley, B. Hormone action in the mammary gland. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (12), a003178 (2011).
- Levenson, A. S., Jordan, V. C. MCF-7: the first hormone-responsive breast cancer cell line. Cancer Res. 57 (15), 3071-3078 (1997).
- Tanos, T., Rojo, L. J., Echeverria, P., Brisken, C. ER and PR signaling nodes during mammary gland development. Breast Cancer Res. 14 (4), 210 (2012).
- Roskelley, C., Desprez, P., Bissell, M. Extracellular matrix-dependent tissue-specific gene expression in mammary epithelial cells requires both physical and biochemical signal transduction. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (26), 12378-12382 (1994).
- Kass, L., Erler, J. T., Dembo, M., Weaver, V. M. Mammary epithelial cell: influence of extracellular matrix composition and organization during development and tumorigenesis. Int J Biochem Cell Biol. 39 (11), 1987-1994 (2007).
- Graham, J. D., et al. DNA replication licensing and progenitor numbers are increased by progesterone in normal human breast. Endocrinology. 150 (7), 3318-3326 (2009).
- Wang, J., et al. Comment on "Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast". Sci Transl Med. 5 (215), 215le214 (2013).
- Brisken, C. Progesterone signalling in breast cancer: a neglected hormone coming into the limelight. Nat Rev Cancer. 13 (6), 385-396 (2013).
- Xu, R., Boudreau, A., Bissell, M. J. Tissue architecture and function: dynamic reciprocity via extra- and intra-cellular matrices. Cancer Metastasis Rev. 28 (1-2), 167-176 (2009).
- Tanos, T., et al. Progesterone/RANKL is a major regulatory axis in the human breast. Sci Transl Med. 5 (182), 182ra155 (2013).
- Yalcin-Ozuysal, O., et al. Antagonistic roles of Notch and p63 in controlling mammary epithelial cell fate. Cell Death Differ. 17 (10), 1600-1610 (2010).
- Hines, W. C., Su, Y., Kuhn, I., Polyak, K., Bissell, M. J. Sorting out the FACS: a devil in the details. Cell Rep. 6 (5), 779-781 (2014).
