Funktionell karakterisering av Na Published: March 30, 2015 doi: 10.3791/52453

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Nina Milosavljevic*¹, Mallorie Poët*¹, Michael Monet¹, Eléonore Birgy-Barelli¹, Isabelle Léna¹, Laurent Counillon¹

¹Université Nice-Sophia Antipolis, Laboratoire de Physiomédecine Moléculaire, CNRS UMR7370, and Laboratories of Excellence Ion Channel Science and Therapeutics

* These authors contributed equally

Abstract

Endosomal försurning är avgörande för ett brett spektrum av processer, såsom protein återvinning och nedbrytning, receptor hyposensibilisering, och signalsubstans lastning i synaptiska vesiklar. Denna försurning beskrivs vara medierad genom proton ATPaser, kopplade till CLC klorid transportörer. Mycket-bevarad elektroneutral protoner transportörer, är Na ⁺ / H ⁺ växlarna (NHE) 6, 7 och 9 uttrycks också i dessa fack. Mutationer i deras gener har kopplats med mänskliga kognitiva och neurodegenerativa sjukdomar. Paradoxalt nog deras roller förblir svårfångad, eftersom deras intracellulära lokalisering har förhindrat detalj funktionell karakterisering. Detta manuskript visar en metod för att lösa detta problem. Denna består av val av muterade cellinjer, som kan överleva akut cytosolic försurning genom att behålla intracellulära NHE vid plasmamembranet. Den skildrar sedan två kompletterande protokoll för att mäta jon selektivitet och aktivitetav dessa värmeväxlare: (i) en baserad på intracellulära pH-mätningar med hjälp av fluorescens videomikroskopi, och (ii) en som bygger på de snabba kinetik litiumupptag. Sådana protokoll kan extrapoleras för att mäta andra icke-electrogenic transportörer. Dessutom urvalsförfarandet presenteras här genererar celler med en intracellulär behålla defekt fenotyp. Därför dessa celler kommer också uttrycker andra vesikulär membranproteiner på plasmamembranet. Den experimentella strategi avbildas här kan därför utgöra ett potentiellt kraftfullt verktyg för att studera andra intracellulära proteiner som kommer att sedan uttrycks på plasmamembranet tillsammans med vesikulär Na ⁺ / H ⁺ växlarna som används för urvalet.

Introduction

De flesta intracellulära fack visar ett surt luminal pH, vilket är en viktig parameter för mognad, trafficking, återvinning av proteiner eller hormoner och signalsubstanser lastning. Det har visats att pH-gradienten mellan cytosolen och vesikulär innehåll genereras av vakuolär H ⁺ ATPaser ^1, kopplad till vesikulära clc klorid transportörer ^2. Både i knock-out (KO) möss och mänskliga patienter, har betydelsen av dessa transportörer lyfts fram av de tunga fenotyper orsakas av mutationer i sina gener ^3-6.

Medlemmarna i Natrium-Hydrogen växlarna SLC9A familj, kallas också NHE för Na ⁺ / H ⁺ växlarna, har visat sig vara viktiga effekten i intracellulär pH och cellvolym reglering, samt i vectorial transport av syra-bas-ekvivalenter över epitel . Förutom plasmamembran NHE, tre högkonserverade Na ⁺ / H ⁺ växlare, NHE 6, 7och 9 uttrycks i trans Golgi nätet och i tidiga endosomer ^7. Mutationer i deras gener har kopplats med Angelmans liknande eller Christi syndrom ^8-9, familjebaserad autism ¹⁰ och Attention Deficit Hyperactivity Disorder ^11-12. Dessa växlarna har också varit inblandad i neurodegenerativa problem såsom Alzheimers sjukdom mottaglighet ¹³ och X-länkade mental retardation intilliggande gener syndrom ^14. Sammantaget ger dessa studier belysa vikten av dessa intracellulära NHE i hjärnans utveckling och / eller funktion.

Den intracellulära lokaliseringen av dessa värmeväxlare förhindrar noggranna mätningar av deras jon selektivitet, transportriktningen, kinetiska parametrar och reglering. Som är fallet för alla transportörer som uttrycks i intracellulära fack, är det extremt svårt att bedöma deras biokemiska aktiviteter och därmed till fullo förstå deras fysiologiska roller och mechanismer underliggande deras patologiska konsekvenser. Baserat på den höga cytosoliska K ⁺ koncentrationen, var den mest allmänt accepterade hypotesen att de arbetade som K ⁺ kopplade proton uttransportörer. Förekomsten av en sådan protonläcka hade hypotes, eftersom det kan motverka protonpumpning av V-ATPaser för att upprätthålla ett stabilt tillstånd vesikulär pH. Syftet med denna visuella artikeln är (i) för att visa en metod som tillåter den genetiska urval av cellinjer som uttrycker sådana vesikulära transportörer vid deras plasmamembran, och (ii) för att visa två oberoende metoder för att mäta funktionerna för dessa transportörer.

Tre decennier sedan, Pouysségur och Franchi har banat en genetisk metod som gjorde det möjligt för molekylär kloning och karakterisering av medlemmarna i NHE familjen ^15. Detta baserades på toxicitet intracellulära protoner som en screeningmetod. Det första steget var att få cellinjer bristfälligi någon Na ⁺ / H ⁺ utväxling på plasmamembranet med hjälp av reversibilitet av denna transportör. Fibroblaster (CCL39 cellinje) var förladdad med Na ⁺ eller Li ⁺ och placerades sedan i ett surt extracellulärt medium (pH 6,5) under 2 h. Detta ledde till döden av celler som uttrycker en funktionell Na ⁺ / H ⁺ utbyte och till valet av antiport-brist celler (PS120 cellinje) ^16. När odlas i bikarbonat fritt medium, dessa celler är mycket känsliga för akut intracellulär försurning. Följaktligen kommer uttrycket av någon funktionell proton effluxmekanism vid plasmamembranet positivt väljas (se ^17), om sådana celler in till akuta intracellulära acidifications. Sådana försurnings tekniker kan användas för att isolera cellinjer med trafficking defekter som möjliggör forcerad expression av WT intracellulära NHE vid plasmamembranet.

Som eukaryot Na ⁺ / H⁺ Växlare är elektroneutral, de är inte mätbar med de elektrofysiologiska metoder som har använts med stor framgång för att mäta kanaler. Detta manuskript visar därför hur man mäter aktiviteten hos detta växla av intracellulära pH-mätningar och snabb kinetik av litium upptag. Som de underliggande begreppen är desamma, är det intressant att notera att många av de processer som utvecklats för sektionen urvalet också används direkt för funktionella mätningar.

Intressant nog har vi observerat att trafficking defekt närvarande i cellinjer utvalda med hjälp av metod som beskrivs i detta manuskript leder till ett större uttryck av andra vesikulära proteiner vid plasmamembranet såsom vesikulär kaliumkanalen TWIK1 ^18. Detta pekar ut mot valet av en allmän behålla defekt mekanism för vesikulära transmembranproteiner. Därav denna urvalsförfarandet och de celler som den genererar majutgör ett lovande verktyg för det vetenskapliga samfundet arbetar på membranproteiner av intracellulära fack. Samt de mätmetoder som presenteras här kan vara tillämpliga för att studera andra icke-electrogenic transportörer.

Protocol

1. H ⁺ Killing Urval

1. Cellinjer
   1. Stabilt transfektera NHE-fattiga celler (t.ex. den CCL39-härledda PS120 cellinje ¹⁶⁾ med vilken kombination av däggdjursexpressionsvektor och transfektion metod som kommer att producera effektiva transfektion avkastning och val i en fibroblastcellinje.
      OBS: Under många år kalciumfosfatutfällning ¹⁹ användes med goda transfektion avkastning. Detta har på senare tid ersatts av kommersiella reagens såsom Lipofectamine2000, varvid transfektionerna utföras genom att följa tillverkarens instruktioner.
2. Lösningar
   1. Förbered tre sterila lösningar beskrivs enligt nedan. Sterilisera dessa lösningar genom filtrering (0,22 um).
      1. Förbered en NH ₄ ⁺ laddas lösning (pH 7,4) bestående av 50 mM _NH4CI, 70 mM kolinklorid, 5 mM KCl, 1 mM _MgCl2, 2 mM _CaCl2, 5 mM glucose och 15 mM MOPS vid pH 7,4.
      2. Bered en skölj lösning (pH 7,0) bestående av 120 mM kolinklorid, 5 mM KCl, 1 mM _MgCl2, 2 mM _CaCl2, 5 mM glukos och 15 mM HEPES vid pH 7,0.
      3. Bered en återställningslösning (pH 7,4) bestående av 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM _MgCl2, 2 mM _CaCl2, 5 mM glukos och 15 mM HEPES vid pH 7,4.
3. Före start av selektion, erhålla en cellkultur inkubator som kan användas vid 37 ° C utan ytterligare _CO2 från externa tanken (benämnd CO ₂ - "fri" inkubator), såsom 5% CO ₂ kommer att resultera i buffring som kan försämra försurning. Förstärka cellinje som uttrycker NHE ränte upp till ca 2 x 10 ⁸ celler (typiskt ca 20 sammanflytande 100 mm plattor).
4. H ⁺ döda förfarande:
   1. Inkubera cellerna som uttrycker den intracellulära NHE av intresse för en timme i Loading Solution, vid tre7 ° C i _CO2-fri inkubator.
   2. Aspirera laddningslösningen och skölj dem två gånger i det ovan beskrivna-sköljlösning. Utför detta steg effektivt för att eliminera rest extracellulärt _NH4CI som skulle försämra skapandet av en brant _NH4 ⁺ lutning som kommer att generera försurningen.
   3. Eliminera sköljmediet genom aspiration och inkubera cellerna i en timme i återställningslösning igen vid 37 ° C i _CO2 fri inkubator.
   4. Byt ut återställningsmedium med normalt odlingsmedium (typiskt DMEM med 7,5% FCS) och odla cellerna i standardodlingsbetingelser (37 ° C i en fuktad atmosfär av 5% _CO2 och 95% luft).
5. Upprepa denna cykel av valet två gånger i veckan fram till stabila kloner dyker.
   OBS: Var särskilt försiktig om cellodling och urvalsvillkor. Månaders arbete kan förstöras av någon förorening som är mer benägna att occur efter en lång period av kultur och upprepade cell manipulationer.
   1. Här väljer du om att förstärka klonerna och karakterisera dem individuellt vilket beskrivs ytterligare i avsnitten 2-3, eller slå ihop dem för att skapa en cellulär population innan karakterisering.
6. Applicera enstaka urval (ca en gång varannan vecka) för att behålla de försurningståliga celler genom kontra välja dem som kan ha återgått till det föräldrasyrakänsliga fenotyp (Figur 1B).

2. Intracellulär pH Mätningar

2.1) Fluorescens pH Imaging

1. Använd kvotmetrisk pH-känsligt fluorescerande färgämne BCECF / AM, vilket är pH-känsligt när den exciteras vid 490 nm och har en 445 nm isosbestisk punkt, efter tillverkarens protokoll.
   1. Alternativt använda andra pH-känsliga sonder, efter tillverkarens protokoll.
2. Använd en avbildning inställt conbestående av ett inverterat mikroskop kopplat till en hög känslighet videokamera. Utrusta denna uppsättning med 450 nm och 490 nm smalbandiga interferensfilter parade med lämplig kvarts neutral densitet filter för excitation.
   1. Om möjligt, använd lämplig uppsättning av filter och belysningsförhållanden till inställnings jämförbara fluorescens värden för λ1 och λ2 så att förhållandet närmar 1. Undvik också basala fluorescensvärden som ställs in antingen mättar eller för lågt, både för λ1 och / eller λ2. Detta kan ge viktiga artefakter som då förhållandet inte varit detekterbara även intracellulära pH förändras.
      OBS: Detta system måste möjliggöra snabb perfusion, tidsförlopp excitation vid de två ovannämnda våglängder och förvärv i rätt emissionsvåglängden (535 nm för BCECF). Utrusta systemet med mjukvara för automatisk datainsamling och lagring.

2.2) Mätning av NHE Forward aktivitet (Extrudering avProtoner från cytosolen)

1. Surgör celler genom en 1 h inkubation i _NH4 ⁺ laddas lösning (se steg 1.4) i frånvaro av _CO2.
2. Lägg BCECF-AM (5 iM slutlig koncentration) till lösningen för de senaste fem minuter och sedan skölj den med NH ₄ ⁺ laddningslösning för att eliminera den extracellulära sonden.
3. Montera cellerna på mikroskop och ta flera bilder för att spela in en stabil baslinje. BEGJUTA sköljlösningen (se ovan). Detta resulterar i en droppe av fluorescens som motsvarar den försurning.
4. Efter pH-stabilisering, BEGJUTA någon av de lösningar som anges nedan för att mäta pH-återvinningsnivåer som förmedlas av Li ⁺ / H ^+, Na ⁺ / H ⁺ eller K ⁺ / H ⁺ utbyte. Varje lösning innehåller en potentiell koppling katjon som testas för H ⁺ utbyte. Om en av dem transporteras, kommer detta att resultera i en ökning fluorescens vid 495 nm som kommer CORRESPOND till en höjning i intracellulärt pH:
   120 mM LiCl, 5 mM KCl, 1 mM _MgCl2, 2 mM _CaCl2, 5 mM glukos och 15 mM HEPES vid pH 7,4
   120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM _MgCl2, 2 mM _CaCl2, 5 mM glukos och 15 mM HEPES vid pH 7,4
   125 mM KCl, 1 mM _MgCl2, 2 mM _CaCl2, 5 mM glukos och 15 mM HEPES vid pH 7,4

2.3) Mätning av NHE Omvänd aktivitet

OBS: Principen här är att invertera trans joniska gradienter.

1. Före mätning, ladda cellerna med den intracellulära ningen av intresse (se nedan).
2. Inkubera dem i 5 min med BCECF / AM (se steg 2.2.2); Skölj dem, montera dem på videomikroskop.
3. BEGJUTA laddningslösningen och ta flera bilder för att spela in en stabil baslinje.
4. Efter baslinjen stabilisering, bild pH variationer när celler perfusion med ett extracellulärt surt medium innehållande 120 mM kolinklorid, 5 mM KCl, 1 mM _MgCl2, 2 mM _CaCl2, 5 mM glukos och 15 mM MES vid pH 6,5.
5. För LiCl lastning, inkubera celler under 2 h i en lösning sammansatt av 120 mM LiCl, 5 mM KCl, 1 mM _MgCl2, 2 mM _CaCl2, 5 mM glukos och 15 mM HEPES vid pH 7,4. Intracellulär litium mätt med atomabsorptionsspektroskopi ger ett värde på cirka 60 mM.
6. För Na ⁺ lastning, inkubera celler för två timmar i en lösning som består av 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM _MgCl2, 2 mM _CaCl2, 5 mM glukos och 15 mM HEPES vid pH 7,4 i närvaro av 1 mM ouabain blockera Na / K ATPas. Under dessa förhållanden är intracellulär Na ⁺ koncentration i intervallet 40 mM.
   OBS: K ⁺ lastning är inte nödvändigt eftersom cytosoliska K ⁺ koncentration är i intervallet av 140 mM och en utåtriktad K + gradienten är därför lätt att uppnå.

2.4) Data Behandling och kalibrering:

OBS: Detta steg gäller både fram- och back mätningar.

1. Vid slutet av varje experiment, BEGJUTA celler med en lösning av 140 mM KCl, 20 mM HEPES och 5 pM nigericin justeras till pH-värden mellan 6,5 och 7,4.
2. Samla data som fluorescensmätningar från bilderna (grå nivåer som representerar intensitetsnivåer) och export under textformat och behandla som förklaras nedan med hjälp av ett kalkylprogram.
3. Beräkna intracellulära pH-värden för varje enskild cell eller region av intresse med hjälp av följande ekvation:
   pH = pKa + (Log (R-Rmin) / (R _max -R)) x F _{min (λ2)} / F _{max (λ2)}
4. Använd F _{min (λ2)} / F _{ma x (λ2)} förhållandet om det finns sond blekning eller läckage, vilket resulterar i en minskning av 450 nm fluorescens under experimenten. Detta är dock mycket sällan hos de villkor som används i desfaktorer beskrivs experiment.
5. Som kalibreringsdata är närvarande vid slutet av varje pH-mätning, kontrollera om motsvarande beräknade värden avviker från pH-värden som används för kalibrering. Om det är fallet, sedan justera alla experimentellt bestämda pH-värden till kalibreringen på följande sätt:
   1. Beräkna följande kvoten (Q, skillnaden mellan den uppmätta värden / Skillnad mellan kalibreringsvärdena). Multiplicera hela dataset av Q. Gör den slutliga justeringen genom addition eller subtraktion så att de beräknade värdena kommer lika motsvarande kalibreringsvärden.

3. Mätningar av Initiala priser i NHE7 by Snabb Li ⁺ Upptag

1. Seed celler på multibrunnsplattor (6 till 24 brunnar) och surgör dem med användning av antingen _NH4 ⁺ lastningstekniken beskriven ovan eller alternativt den nigericin / bovint serumalbumin (BSA) syrning beskrivs i ^20.
2. Bibehålla korta och konsekventa upptags löptider (vanligtvis en minut eller lägre) för att se till att transporter är verksamt i initial priser förhållanden. Se också till att alla lösningar som används för upptag är isoton.
3. Vid slutet av upptagningstiden, noggrant eliminera upptagningsmediet och tvätta cellerna fyra gånger med iskall fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Utför dessa tvättar så snabbt som möjligt (mindre än 10 sekunder för fyra av dem är perfekt) för att förhindra litium utflöde.
4. Lysera cellerna i 25% salpetersyra. Applicera 250 pl per brunn av 25% salpetersyra och låt det sitta i minst en timme, sedan skrota varje brunn med änden av pipettspetsen och överföra hela väl suspensionen i ett nytt microcentrifuge röret.
5. Överför lysatet i 1,5 ml mikrocentrifugrör, centrifugera dem för 5 minuter vid 15.000 xg (rumstemperatur) för att avlägsna cellulärt skräp.
6. Mät halten litium i supernatanterna genom atomabsorptionsspektroskopi ^21.
   OBS: Olika företag ger Atomabsorption spektrometrar, som måste vara utrustade med ett litium hålkatod lampa. Följ tillverkarens anvisningar som dessa maskiner är mycket exakt, men också ganska känslig.

Representative Results

Urval:

H ⁺ dödande val är baserad på diffusion av ammonium svag bas, såsom avbildas i Figur 1A. Effekten av svaga baser och syror diffusion på intracellulära pH har uppfunnen av Walter Boron och medarbetare ^22. Den eleganta idé att använda detta fenomen för att producera en dödlig försurning för positiva genetiska urvalet utvecklades sedan av Jacques Pouysségur ^17. Enligt ett sådant protokoll, det intracellulära pH-värdet sjunker till ungefär 5,5 efter sköljningssteget. Celler som inte uttrycker en funktionell NHE vid plasmamembranet kan inte återställa ett neutralt pH-värde och visar en typisk surgjord aspekt med en platt form och en granulär cytosolen (Figur 1B). Efter upprepade selektionscykler (ca två H ⁺ dödar förfaranden / vecka), celler som fullständigt och stabilt överleva denna surgörning (Figur 1C) fram, vid en frekvens av ca 10 ^-7.Detta kommer att resultera i bildning av enskilda cellulära kloner som antingen kan karakteriseras individuellt eller poolade att erhålla cellpopulationer om så önskas. Standard experiment såsom cellytan biotinylering eller RNA ljuddämpning kan utföras för att kontrollera att det protein som uttrycks på plasmamembranet är verkligen en intracellulär NHE såsom NHE7 (se exempelvis Milosavljevic et al. ^18). Vad bra, bör RT-PCR och efterföljande sekvense utföras för att kontrollera om det finns eventuella mutationer i sekvensen av de intracellulära NHE uttrycks i den valda cellinje.

Funktionell karakterisering:

Fluorescens Videomicroscopy:

Aktiviteten och jon selektivitet av de intracellulära NHE som uttrycks på plasmamembranet kan karakteriseras genom mätning av förändringar i intracellulärt pH inducerad av dessa NHE i olika förhållanden. För detta en videomicroscopy set utrustad med belysning end förvärvs inställningar till bilden en ratiometrisk prob såsom BCECF / AM är schematiserad i figur 2A. Figur 2B och 2C visar de typiska variationerna i fluorescensvärden direkt erhållna för excitationer vid 490 och 450 nm, efter en NH ₄ ⁺ loading försurning. Figur 2D visar pH kurva som erhålls av dessa fluorescensvärdena följande data behandling som beskrivs i 2.4).

Litium Upptag:

Tillsammans med väte och natrium, omfattar litium del av den första kolumnen i det periodiska systemet och har visat sig vara en effektiv koppling katjon för Na ⁺ / H ⁺ växlarna. Det är möjligt att dra nytta av denna information till inställnings snabb kinetik litiumupptag, för att mäta i detaljerna de funktionella parametrar Na ⁺ / H ⁺ växlarna. Eftersom denna katjon är frånvarande från cellens cytoplasma, gasansamling vid cytosolic försurning kommer kvantitativt spegla aktiviteten av plasmamembranet NHE. Dessutom kan nanomolär till pikomolar koncentrationer av litium mätas med stor noggrannhet med hjälp av atomabsorptionsspektrometri. Således är denna metod mycket kraftfull när den kombineras med val av plasmamembran uttryckta vesikulär växlarna. Figur 3 illustrerar mätprotokoll som beskrivs i 3) i avsnittet protokoll. Celler, företrädesvis ympade på flerbrunnsplattor (6-24) surgörs såsom tidigare beskrivits. Den kinetiska börjar med inkubering av cellerna i medium innehållande litium, och de andra katjoner eller inhibitorer av intresse (figur 3A).

För att stoppa upptaget, celler sedan fram till fyra snabba sköljningar i iskallt PBS. Rörelse snabbt avlägsnar all extracellulära litium samtidigt säkerställa att ingen signifikant litium utflöde sker (Figur 3B). Litium koncentrationen i varje brunn är dåmätt med användning av atomabsorptionsspektroskopi (fig 3C), och initiala hastigheter av Lithium upptag, vilket direkt gav aktiviteten av värmeväxlaren vid steady state erhålls som lutnings mätningar av litium ackumulering tidsförloppet (Figur 3D).

Såsom för enzymkinetik, kan dos-respons av initiala hastigheter användas för att härleda Km-värden för substrat (figur 4A) av Ki-värden för inhibitorer. Ett intressant inslag i transportörer är att olika kopplings katjoner kommer att konkurrera om transporter. Detta ger den möjligheten att mäta Km för natrium genom konkurrens med litiumupptagning (Figur 4B).

Figur 1: Selektion av celler som uttrycker en intracellulär Na ⁺ / H ⁺ </ Strong> växlare på deras plasmamembran. (A) En strategi för de tre stegen H ⁺ dödande urval av celler som uttrycker en funktionell icke-muterade och icke-märkta intracellulär NHE vid plasmamembranet. (B) faskontrastmikroskopi bild av PS120 moderceller som lämnas in till en syrabelastning. Skalstreck: 25 ^ m (C) faskontrastmikroskopi avbildar av PS120 celler valda för expression av en vesikulär växlare vid plasmamembranet, efter syrabelastning. Skala bar: 25 pm Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Intracellulära pH-mätningar (A) Principen om pH videomicroscopy mätning.. (B) Evolution av den emitterade fluorescens (595 nm) av BCECF pH-sonden efter en excitation vid 490 nm. L: syrabelastning, Ri; Skölj, Re: återhämtning, Cal6.5: kalibrering på en intracellulär pH på 6,5, Cal7.0: Kalibrering på en intracellulär pH på 7,0 (C) Utveckling av den emitterade fluorescens (595 nm) av BCECF pH-sonden efter en excitation vid 450 nm. L: syrabelastning, Ri; Skölj, Re: återhämtning, Cal6.5: kalibrering på en intracellulär pH på 6,5, Cal7.0: Kalibrering på en intracellulär pH på 7,0 (D) Utveckling av den intracellulära pH beräknas från 490/450 nm fluorescens nyckeltal i BCECF pH sond och från kalibreringspunkterna. L: syrabelastning, Ri; Skölj, Re: återhämtning, Cal6.5: kalibrering på en intracellulär pH på 6,5, Cal7.0: Kalibrering på en intracellulär pH på 7,0 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3:. NHE-aktivitet mäts med initiala hastigheter av Li ⁺ upptag (A - C) Scheme avbildar de olika kritiska stegen i mätteknik (D) Exempel på en uppmätt tidsförloppet av litium upptag för vesikulär NHE7 växla uttryckte vid plasma membran. Notera linearitet kinetiska inom försöksbetingelserna, säkerställer initiala priser mätning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: Typisk Dos-responskurvor för NHE7 (ursprungliga data från ^18).Initiala hastigheter av Lithium upptag mättes med hjälp av 1 minut kinetik. (A) Dos-responskurvan för extracellulär litium. (B) Konkurrens på olika koncentrationer av extracellulärt natrium på 1 mM extracellulärt litiumupptag. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Detta protokoll beskriver hur man väljer celler som uttrycker intracellulära Na ⁺ / H ⁺ växlarna vid plasmamembranet utan att deras primära sekvens genom riktad mutagenes. Dessa värmeväxlare kan nu karakteriseras.

Denna metod är baserad på den cellulära toxiciteten hos intracellulära protoner för att välja cellinjer som kommer att uttrycka vesikulär Na ⁺ / H ⁺ växlarna vid plasmamembranet. Det kan vara möjligt, i princip, att använda andra katjoner som kan misstänkas att transporteras, såsom Li ^+, K ^+, eller Cs ^+. Men tillägger detta ytterligare en nivå av osäkerhet. Om valet inte ger någon positiv klon, kommer det då att bli svårt att bedöma om den testade katjonen inte transporteras eller värmeväxlaren inte vid plasmamembranet. Av dessa skäl har markeringar utförts med användning av Na ⁺ som ett kopplings katjon eftersom detta är den extracellulära substråt finnas i högsta överflöd i fysiologiska förhållanden. Detta ledde till att valet av varianter som uttrycker NHE7 ^18, samt NHE6 och NHE9 vid plasmamembranet (Poet och Counillon, opublicerade resultat).

Denna plasmamembranuttryck möjliggör mätning av transportörerna funktionella parametrarna genom metoder som kunde hittills endast användas för plasmamembrantransportörer. Naturligtvis är det inte möjligt att utesluta att en sådan förändring i membranmiljö kan påverka de funktionella egenskaperna hos de vesikulära NHE. Dock kan denna strategi vara värt att använda åtminstone tre skäl: (i) den intracellulära uttryck NHE6, 7 och 9 utesluter detaljerad funktionsmätning, (ii) membranmiljöer och protein eller lipid partners har oftast visat sig påverka subtila regelverk mekanismer för de andra NHE och inte deras mycket grundläggande funktioner i dessa transportörer (affinitet för kopplings katjoner, selektivitet, rikt, pharmacological funktioner). Så det är mycket troligt att de kommer att förbli oförändrade av membranet uttryck för de vesikulära NHE. (Iii) att känna till funktionella mekanismer och farmakologiska profiler av ett plasmamembran-uttryckt vesikulär mekanism, är det då möjligt att göra vesikulär pH-mätningar för att hantera dessa eventuella skillnader mellan plasmamembranet och vesikulär uttryck.

En annan potentiell begränsning av denna teknik är att den strategi som beskrivs här kan leda till selektion av celler som uttrycker andra H ⁺ sprutmekanism än den transfekterade vesikulära Na ⁺ / H ⁺ växlar (såsom en plasmamembran NHE, eller en H ⁺ ATPas t.ex. ). Även om det var aldrig observerats i laboratoriet, är det därför viktigt att använda klassiska cellytan märkning kopplad till tysta att faktiskt kontrollera att NHE intressanta faktiskt uttrycks på plasmamembranet och förmedlar Na ⁺ eller Li ⁺ et al. ^18).

För att karakterisera aktiviteten hos dessa transportörer, två protokoll, respektive baserat på intracellulära pH-variationer och jonflöden beskrivs. Den första metoden kräver användning av pH-känsliga fluorescerande prober och en lämplig fluorescens videomikroskopi systemet. Denna metod, som används av många grupper i fält, har utvecklats under 1980-talet, först med hjälp fluorimeters att mäta signaler i form celler i suspension ^23, sedan använda digital förvärv för att mäta enskilda celler genom koppling fluorescensexcitation och förvärv att videomicroscopy ^24. Den senare tekniken har nu blivit mycket snabbt och enkelt, beroende på den höga prestanda för kameror, belysning och datorsystem. Intressant, företag brukar ge mycket informativa faktablad tillsammans med sina fluorescerande prober. Dessa pH-variationer ger viktig informationatt bestämma vilken typ av extracellulära katjoner tillsammans med proton utflöde. I detta avseende är det viktigt att notera att den tid som ammonium förinkuberingen måste noggrant justeras beroende på de celler som används för mätningarna. CCL39-härledda fibroblaster, stöder mycket väl en timmes laddning med 50 mM _NH4CI. Detta resulterar i en mycket stark försurning som gör NHE full aktivering och ger en stark signal för mätningar (Vmax villkor). Emellertid skulle andra celler som hjärtmuskelceller eller primära njurceller inte stödja en sådan en viktig ammonium lastning. Det är värt att utföra flera preliminära försök med olika inkuberingstider eller _NH4CI koncentrationer. Orsaken till dessa skillnader i känslighet för NH ₄ Cl är inte klart. De kan vara relaterade till den möjliga uttryck för ammonium transportsystem ^25,26. Likaså den natriumfria lösning som används för sköljning laddningslösningen inte kan tolererasav celler, såsom kardiomyocyter till exempel. Även om de första hastigheter kommer att mindre exakt bestämmas, är det nödvändigt att BEGJUTA direkt med återställningslösningen efter ammonium lastning.

Dessutom intracellulära pH-mätningar ger också ett enkelt sätt att undersöka reversibla egenskaperna hos dessa värmeväxlare som det omvända läget kommer att producera en försurning som kommer att vara lätt upptäckas genom en minskning av BCECF fluorescens nivå som kan uttryckas som en pH-värden efter kalibrering . Begränsningarna av dessa experiment är brist på en exakt kvantifiering av transportverksamheten, eftersom experimenten mäter pH-variationer, som verkar på en logaritmisk skala och begränsas av intracellulär buffertkapacitet. Det senare kan mätas och pH-variationer multiplicerat med buffringskapacitet avkastnings jonflöden. Men denna process kombinerar flera experimentella fel (på pH-mätningar, mätningar buffringskapacitet, och Calibration) och är därför inte mycket kvantitativ. Därför för att komma åt de enzymatiska konstanterna hos plasmamembranet uttryckt transportör, snabb jonflödet tekniker är mycket enklare och korrekt.

Eftersom intracellulära innehåll är i millimolära sortimentet, upptäcka NHE-medierade förändringar i cytosoliskt natrium är inte möjligt. Hädanefter, åratal sådana upptags tekniker som bygger på användning av radioisotoper, såsom ²² Na ^+. Detta manuskript beskriver en icke-radioaktiv metod för vilka ²² Na ⁺ ersätts av litium, baserad på den logiska grunden att denna katjon som också används av NHE, är frånvarande från cell cytosolen och kan mätas med stor noggrannhet med hjälp av atomabsorptionsspektrometri ^21. När lämpliga förhållanden (tid och litiumkoncentration) för att mäta linjära upptag (ie., Att vara i initial priser förhållanden) bestäms, tillhörighet till andra potentiella kopplings katjoner och / ellerinhibitorer kan mätas noggrant, såsom visas i figurerna 3 och 4. En sista potentiell begränsning är att litiumupptag metoden givetvis kan fungera endast om växlaren intresse transporterar betydligt denna katjon. Om det inte är fallet, kommer försöks måste förlita antingen på ovan nämnda intracellulära pH-mätningar eller kommer att behöva använda radioaktiv natriumupptag.

En sådan uppsättning experiment har lett nyligen lett till observationen att NHE7 intracellulär Na ⁺ / H ⁺ växlare, som ursprungligen tros vara en H ⁺ / K ⁺ transportör som skulle alkalinize vesiklar var i själva verket en endosomal försurning mekanism kopplad till natrium ^18. Detta har djupa konsekvenser för intracellulära fack som hittills denna roll ansågs vara ägnas åt VH ⁺ ATPaser. Eftersom varje medlem av NHE familjen verkar visa en mycket specifik kinetisk signatur ovinge till dess fysiologiska roll, är det frestande att anta att kvalificeringen av NHE6 och NHE9 med de metoder som beskrivs i denna artikel kommer att avslöja nya och oväntade egenskaper som kommer att belysa deras fysiologiska funktioner.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Standard cell culture equipement			Used for H+ killing selection composed of many devices with different catalog numbers
Incubator with CO2	Sanyo	MCO15A
Incubator without CO2	Heraeus instrument	BB6220
Laminar flow hood PSM1200NF	Fisher	52010120
DMEM medium	sigma	D5796
FBS gold	GE Healthcare	A15-151
Penicilin/streptomycin	PAA	P11-010
Trypsin 10x	PAA	L11-003
Atomic Absorption spectrometer with Zeeman furnace system	Thermo Scientific	ICE 3500 GFZ
LiCl	sigma	L4408
Nitric Acid	sigma	438073
Fluorescence videomicroscopy set	Leica		Composed of many devices with different catalog numbers
Inverted automated microscope	Leica	DMI6000B
microscope stand	leica	11888906
		11888911
		11505180
		11888377
incident fluorescence	leica	11888901
		11504166
motor bracket	leica	11888379
		11505234
		11521505
		11522106
LED transmission light	leica	8097321
		8102034
		11521580
motorized plate	leica	11522068
		11531172
		11521734
		11521719
		11888423
		11888424
camera output	leica	11888373
		11507807
		11888393
		11888259
		11888258
		11541510
images acquisition/analysis software	leica	11888375
optics	leica	11506507
		11506243
		11506203
fluorescence Xenon lamp	leica	DMI6000
camera	hamamatsu	8100601
metafluor/Mmfluor software		11640905
pH sensitive probe, BCECF-AM	life technologies	B1170
Nigericin	Sigma	N7143