Undersøgelse Single Molecule Vedhæftning af Atomic force spektroskopi
Summary
A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.
Abstract
Atomic force spektroskopi er et ideelt værktøj til at studere molekyler ved overflader og grænseflader. En forsøgsprotokol at koble en lang række enkelte molekyler kovalent på en AFM spids præsenteres. Samtidig AFM spids passiveres at forhindre uspecifikke interaktioner mellem spidsen og substratet, hvilket er en forudsætning for at studere enkelte molekyler knyttet til AFM spids. Analyser til bestemmelse af vedhæftning kraft, vedhæftning længde, og den gratis energi af disse molekyler på faste overflader og bio-interfaces er kort præsenteret og eksterne henvisninger til yderligere læsning leveres. Eksempel molekyler er poly (aminosyre) polytyrosine, graftpolymeren PI- g-PS og phospholipidet POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin). Disse molekyler er desorberet fra forskellige overflader som CH 3 -SAMs, brint termineret diamant og støttede lipiddobbeltlag under forskellige opløsningsmiddelbetingelser. Endeligfordele ved force spektroskopiske enkelt molekyle eksperimenter diskuteres herunder midler til at beslutte, om virkelig en enkelt molekyle er blevet undersøgt i forsøget.
Introduction
I løbet af de seneste 30 år har atomic force mikroskopi (AFM) viste sig at være en værdifuld billeddannelse teknik til at studere biologiske 1,2 og syntetiske 3-materiale og overflader, da det giver molekylær rumlig opløsning i alle tre dimensioner, og kan betjenes i forskellige opløsningsmiddel miljøer. Desuden AFM-enkelt molekyle force spektroskopi (SMFS) gør det muligt at måle kræfter lige fra PN til μN regime og har givet hidtil uset indsigt f.eks til protein foldning 4,5, polymer fysik 6-8, og enkelt molekyle-overflade interaktionen 9 – 12 .Den rationale bag studere enkelte molekyler snarere end et ensemble af molekyler er at undgå gennemsnit virkninger, som ofte maskerer sjældne begivenheder eller skjulte molekylære tilstande. Endvidere kan en lang række molekylære parametre, såsom kontur længde, Kuhn længde adhæsionen fri energi, etc. væreopnået. Dette er nærmere beskrevet i eksemplerne nedenfor. I en typisk AFM-SMFS eksperiment probemolekylet koblet til en meget skarp spids via et linkermolekyle. Spidsen selv er placeret ved enden af en bøjelig cantilever. Hvis spidsen bringes i kontakt med overfladen probemolekylet vil interagere med denne overflade. Ved at observere afbøjningen af udliggeren ved tilbagetrækning af spidsen, den kraft og dermed den frie energi, for at frigøre molekylet fra overfladen kan bestemmes. For at opnå meningsfulde statistikker, har en lang række såkaldte force afstande kurver, der skal erhverves. Endvidere har sande enkelt molekyle forsøg (dvs. ved hjælp af en og samme probemolekyle over varigheden af hele forsøget) probemolekylet bør kobles kovalent til AFM spids. Her er en forsøgsprotokol til cantilever funktionalisering med et enkelt molekyle via en kovalent binding fremlagt. Den enkelt molekyle kan enten være koblet via en amino- eller en thiol gruppe AFM spids. Konjugeringen kan udføres i en bred række opløsningsmidler (organiske og vandige) redegøre for de solvatisering egenskaber af polymerer, der anvendes.
I den første del, en generel protokol covalent vedhæfte et enkelt molekyle ("probe molekyle") via et linkermolekyle til en AFM spids er beskrevet. Til dette formål, er økologisk NHS- eller maleimid-kemi anvendt 13. Sammen med protokollen for tre eksempel molekyler, er datafangst og dataanalyse processer beskrevet og referencer til yderligere læsning leveres. Eksemplet molekyler er: (lineær) polymer tyrosin, graftpolymeren PI- g-PS og lipid POPE. Dette omfatter små variationer i protokollen, for eksempel for at kovalent vedhæfte cysteiner. Desuden er en sektion dedikeret til fremstilling af forskellige overflader, såsom en diamant overflade, en CH3 -Self samlet monolag og lipiddobbeltlag. Disse grænseflader har proven til at være gode referencer og eksempler.
Protocol
Representative Results
Discussion
I de seneste årtier er enkelt molekyle eksperimenter forudsat hidtil uset indsigt i molekylære mekanismer og viste sig at være en uvurderlig tilgang life science og videre. At opnå en god og meningsfulde statistikker fra SMFS eksperimenter, ideelt en og samme molekyle anvendes over hele forløbet af forsøget. I modsætning til forsøg med ensembler af molekyler, SMFS eksperimenter er i stand til at opdage sjældne begivenheder og skjulte molekylære tilstande. En anden fordel ved enkelt molekyle eksperimenter er, a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the DFG (Hu 997/2-2) for financial support. FS acknowledges the Hanns-Seidel-Stiftung (HSS). SKr was supported by the Elitenetzwerk Bayern in the framework of the doctorate program Material Science of Complex Interfaces. SKi thanks the SFB 863 for financial support.
Materials
| Materials | |||
| Hellmanex III alkaline liquid concentrate (detergent solution) | Hellma | ||
| RCA (ultrapure water, hydrogen peroxide (35 %), ammonia (32%); 5:1:1(v/v/v)) | Sigma | ||
| Vectabond reagent / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Vectorlabs | ||
| Dry acetone (< 50 ppm H2O) | Sigma | ||
| Dry chloroform (> 99.9 %) | Sigma | ||
| Triethylamine | Sigma | ||
| Ultrapure water | Biochrom, Germany | ||
| Di-sodium tetraborate (> 99.5 %) | Biochrom, Germany | ||
| Boric Acid | Biochrom, Germany | ||
| Monofunctional α-methoxy-ω-NHS PEG, 5kDa, “methyl-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α,ω-bis-NHS PEG, 6 kDa, “NHS-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α-maleimidohexanoic- ω-NHS PEG, 5 kDa, “Mal-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Probe molecule (polymer, lipid, etc.) | |||
| Equipment | |||
| Sufficient amount of glass crystallising dishes with spout (10 ml), glass petri dishes (500 µl) and glass lids | VWR International GmbH, Germany | ||
| Laboratory oven model UF30 | Memmert, Germany | ||
| Temperature controlled sonicator | VWR International GmbH, Germany | ||
| Plasma system "Femto", 100 W | Diener, Germany | ||
| One separate glass syringe for each organic solvent | VWR International GmbH, Germany | ||
| Vortex mixer | VWR International GmbH, Germany | ||
| Microcentrifuge tubes (0.5 ml or 1.5 ml) | Eppendorf | ||
| Pipettes: 10-100 µl, 50-200 µl and 100-1000 µl | Eppendorf | ||
| AFM with temperature controlled fluid cell (e.g. MFP-3D with BioHeater) | Asylulm Research, Santa Barbara | ||
| Soft SiN cantilevers cantilever, typically made from silicon nitride (SiN) (spring constant less than 100 pN/nm, e.g. MLCT) | Bruker AXS, Santa Barbara |
References
- Scheuring, S., Sapra, K., Müller, D. Probing Single Membrane Proteins by Atomic Force Microscopy. Handbook of Single-Molecule Biophysics. , 449-485 (2009).
- Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy. Nature. 468 (7320), 72-76 (2010).
- Magonov, S. N. Atomic Force Microscopy in Analysis of Polymers. Encyclopedia of Analytical Chemistry. , (2006).
- Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules. Nature Structural Biology. 6 (4), 346-349 (1999).
- Li, H., Linke, W. a., et al. Reverse engineering of the giant muscle protein titin. Nature. 418 (6901), 998-1002 (2002).
- Bustamante, C., Smith, S. B., Liphardt, J., Smith, D. Single-molecule studies of DNA mechanics. Current opinion in structural biology. 10 (3), 279-285 (2000).
- Zhang, W., Zhang, X. Single molecule mechanochemistry of macromolecules. Progress in Polymer Science. 28 (8), 1271-1295 (2003).
- Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H., Netz, R. Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory. Physical Review Letters. 94 (4), 048301 (2005).
- Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction – The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid Ordered and Liquid Disordered Phases. Biophysical journal. 107 (5), (2014).
- Pirzer, T., Hugel, T. Adsorption mechanism of polypeptides and their location at hydrophobic interfaces. Chemphyschem. 10 (16), 2795-2799 (2009).
- Butt, H. -. J., Cappella, B., Kappl, M. Force measurements with the atomic force microscope: Technique, interpretation and applications. Surface Science Reports. 59 (1-6), 1-152 (2005).
- Nash, M. A., Gaub, H. E. Single-Molecule Adhesion of a Copolymer to Gold. ACS NANO. 6 (12), 10735-10742 (2012).
- Hermanson, G. . Bioconjugate Techniques. , (1996).
- Kienle, S., et al. Effect of molecular architecture on single polymer adhesion. Langmuir the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (15), 4351-4357 (2014).
- Folkers, J. P., Laibinis, P. E., Whitesides, G. M. Self-assembled monolayers of alkanethiols on gold: comparisons of monolayers containing mixtures of short- and long-chain constituents with methyl and hydroxymethyl terminal groups. Langmuir. 8 (5), 1330-1341 (1995).
- Dankerl, M., et al. Diamond Transistor Array for Extracellular Recording From Electrogenic Cells. Advanced Functional Materials. 19 (18), 2915-2923 (2009).
- Leonenko, Z. V., Carnini, A., Cramb, D. T. Supported planar bilayer formation by vesicle fusion: the interaction of phospholipid vesicles with surfaces and the effect of gramicidin on bilayer properties using atomic force microscopy. Biochimica et biophysica acta. 1509 (1-2), 131-147 (2000).
- Stetter, F. W. S., Hugel, T. The Nanomechanical Properties of Lipid Membranes are Significantly Influenced by the Presence of Ethanol. Biophysical Journal. 104 (5), 1049-1055 (2013).
- Putman, C. A. J., De Grooth, B. G., Hulst, N. F., Greve, J. A detailed analysis of the optical beam deflection technique for use in atomic force microscopy. Journal of Applied Physics. 72 (1), 6-12 (1992).
- Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Review of Scientific Instruments. 64 (7), 1868 (1993).
- Krysiak, S., Liese, S., Netz, R. R., Hugel, T. Peptide desorption kinetics from single molecule force spectroscopy studies. Journal of the American Chemical Society. 136 (2), 688-697 (2014).
- Li, I. T. S., Walker, G. C. Interfacial free energy governs single polystyrene chain collapse in water and aqueous solutions. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6530-6540 (2010).
- Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).
- Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction: The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Phases. Biophysical Journal. 107 (5), 1167-1175 (2014).
- Horinek, D., et al. Peptide adsorption on a hydrophobic surface results from an interplay of solvation, surface, and intrapeptide forces. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (8), 2842-2847 (2008).
- Ebner, A., et al. Functionalization of probe tips and supports for single-molecule recognition force microscopy. Topics in current chemistry. 285 (April), 29-76 (2008).
- Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor. Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).
- Morfill, J., et al. Affinity-matured recombinant antibody fragments analyzed by single-molecule force spectroscopy. Biophysical journal. 93 (10), 3583-3590 (2007).
