Onderzoekt Single Molecule Hechting van Atomic Force Spectroscopie
Summary
A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.
Abstract
Atomic force spectroscopie is een ideaal hulpmiddel om moleculen aan oppervlakken en interfaces te bestuderen. Een experimentele protocol te koppelen een grote verscheidenheid van afzonderlijke moleculen covalent op een AFM tip wordt gepresenteerd. Tegelijkertijd de AFM tip gepassiveerd om aspecifieke interacties tussen de tip en het substraat, hetgeen een vereiste om enkele moleculen aan de AFM tip bestuderen voorkomen. Analyses om de hechting van kracht, de hechting lengte, en de vrije energie van deze moleculen op vaste oppervlakken en bio-interfaces worden binnenkort gepresenteerd en externe verwijzingen voor verdere lectuur worden verricht. Voorbeeld moleculen zijn de poly (aminozuur) polytyrosine, het entpolymeer PI- g-PS en het fosfolipide POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine). Deze moleculen gedesorbeerd van verschillende oppervlakken, zoals CH3 -SAMs, waterstof beëindigd diamant en ondersteund lipide dubbellagen onder verschillende omstandigheden oplosmiddel. Ten slottevoordelen kracht spectroscopische single molecule experimenten besproken middelen omvat om te beslissen of werkelijk een enkel molecuul is onderzocht in het experiment.
Introduction
In de afgelopen 30 jaar heeft atomic force microscopie (AFM) bleek een waardevolle beeldvormingstechniek bestuderen biologische 1,2 en 3 synthetische materialen en oppervlakken aangezien het voorziet moleculaire ruimtelijke resolutie in alle drie dimensies en kan op verscheidene oplosmiddel worden bediend omgevingen. Daarnaast AFM-single molecule kracht spectroscopie (SMF) in staat stelt om de krachten variërend van de PN-regime μN meten en heeft ongekend inzicht bijvoorbeeld in eiwitvouwing 4,5, polymeerfysica 6 gegeven – 8, en single molecule-oppervlak interactie 9 – 12 .De gedachte achter het bestuderen van enkele moleculen in plaats van een ensemble van moleculen is om te voorkomen dat een gemiddelde effecten die vaak maskeren zeldzame gebeurtenissen of verborgen moleculaire toestanden. Bovendien kan een veelheid aan moleculaire parameters zoals het contour lengte, de lengte Kuhn, de hechting vrije energie, etc. zijnverkregen. Dit wordt in onderstaande voorbeelden. In een typische AFM-SMF experiment wordt de probe molecuul gekoppeld aan een zeer scherpe punt via een linker-molecule. De tip zelf is gelegen aan het einde van een buigzame cantilever. Als de punt in contact met het oppervlak wordt gebracht de probe molecuul interactie met dit oppervlak. Door het observeren van de doorbuiging van de cantilever bij het terugtrekken van de tip, de kracht en daardoor de vrije energie, aan het molecuul los te maken van het oppervlak worden bepaald. Om zinvolle statistiek, een groot aantal zogenaamde kracht-afstand curves moeten worden verworven. Bovendien true single molecule experimenten (bijv via een en dezelfde probe molecuul gedurende de duur van het gehele experiment) het probe-molecuul dient covalent gekoppeld aan de AFM tip bevatten. Hier wordt een experimenteel protocol voor cantilever functionalisering met een enkel molecuul via een covalente binding gepresenteerd. De single molecule kan ofwel gekoppeld via een amino- of thiol groep aan de AFM tip. De conjugatie werkwijze kan worden uitgevoerd in een grote verscheidenheid van oplosmiddelen (organisch en waterig) overeenkomt met het solvatatie eigenschappen van de gebruikte polymeren.
In het eerste deel, een algemeen protocol covalent een enkel molecuul ("probe molecule") te bevestigen via een linker-molecuul aan een AFM tip wordt beschreven. Hiertoe wordt organisch NHS- of maleïmide-chemie gebruikt 13. Samen met het protocol voor drie bijvoorbeeld moleculen, worden de data-acquisitie en data-analyse processen beschreven en referenties voor verdere lectuur zijn aanwezig. Het voorbeeld moleculen zijn: de (lineaire) polymeren tyrosine, het entpolymeer PI- g-PS en het lipide POPE. Dit omvat kleine variaties van het protocol, bijvoorbeeld om covalent cysteïnen. Daarnaast wordt een gedeelte gewijd aan de bereiding van diverse oppervlakken zoals een diamant oppervlak, een CH3–Self monolaag en lipide dubbellagen. Deze interfaces hebben proven zijn goede referenties en voorbeelden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tijdens de laatste decennia hebben enkel molecuul experimenten ongekende inzichten in de moleculaire mechanismen en bleek een aanpak van onschatbare waarde in de life science en daarbuiten. Om een goede en zinvolle statistieken van SMF experimenten idealiter een en hetzelfde molecuul wordt gebruikt over de gehele loop van het experiment te bereiken. In tegenstelling tot experimenten met ensembles van moleculen, SMF's experimenten zijn in staat om zeldzame gebeurtenissen en verborgen moleculaire toestanden te d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the DFG (Hu 997/2-2) for financial support. FS acknowledges the Hanns-Seidel-Stiftung (HSS). SKr was supported by the Elitenetzwerk Bayern in the framework of the doctorate program Material Science of Complex Interfaces. SKi thanks the SFB 863 for financial support.
Materials
| Materials | |||
| Hellmanex III alkaline liquid concentrate (detergent solution) | Hellma | ||
| RCA (ultrapure water, hydrogen peroxide (35 %), ammonia (32%); 5:1:1(v/v/v)) | Sigma | ||
| Vectabond reagent / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Vectorlabs | ||
| Dry acetone (< 50 ppm H2O) | Sigma | ||
| Dry chloroform (> 99.9 %) | Sigma | ||
| Triethylamine | Sigma | ||
| Ultrapure water | Biochrom, Germany | ||
| Di-sodium tetraborate (> 99.5 %) | Biochrom, Germany | ||
| Boric Acid | Biochrom, Germany | ||
| Monofunctional α-methoxy-ω-NHS PEG, 5kDa, “methyl-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α,ω-bis-NHS PEG, 6 kDa, “NHS-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α-maleimidohexanoic- ω-NHS PEG, 5 kDa, “Mal-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Probe molecule (polymer, lipid, etc.) | |||
| Equipment | |||
| Sufficient amount of glass crystallising dishes with spout (10 ml), glass petri dishes (500 µl) and glass lids | VWR International GmbH, Germany | ||
| Laboratory oven model UF30 | Memmert, Germany | ||
| Temperature controlled sonicator | VWR International GmbH, Germany | ||
| Plasma system "Femto", 100 W | Diener, Germany | ||
| One separate glass syringe for each organic solvent | VWR International GmbH, Germany | ||
| Vortex mixer | VWR International GmbH, Germany | ||
| Microcentrifuge tubes (0.5 ml or 1.5 ml) | Eppendorf | ||
| Pipettes: 10-100 µl, 50-200 µl and 100-1000 µl | Eppendorf | ||
| AFM with temperature controlled fluid cell (e.g. MFP-3D with BioHeater) | Asylulm Research, Santa Barbara | ||
| Soft SiN cantilevers cantilever, typically made from silicon nitride (SiN) (spring constant less than 100 pN/nm, e.g. MLCT) | Bruker AXS, Santa Barbara |
References
- Scheuring, S., Sapra, K., Müller, D. Probing Single Membrane Proteins by Atomic Force Microscopy. Handbook of Single-Molecule Biophysics. , 449-485 (2009).
- Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy. Nature. 468 (7320), 72-76 (2010).
- Magonov, S. N. Atomic Force Microscopy in Analysis of Polymers. Encyclopedia of Analytical Chemistry. , (2006).
- Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules. Nature Structural Biology. 6 (4), 346-349 (1999).
- Li, H., Linke, W. a., et al. Reverse engineering of the giant muscle protein titin. Nature. 418 (6901), 998-1002 (2002).
- Bustamante, C., Smith, S. B., Liphardt, J., Smith, D. Single-molecule studies of DNA mechanics. Current opinion in structural biology. 10 (3), 279-285 (2000).
- Zhang, W., Zhang, X. Single molecule mechanochemistry of macromolecules. Progress in Polymer Science. 28 (8), 1271-1295 (2003).
- Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H., Netz, R. Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory. Physical Review Letters. 94 (4), 048301 (2005).
- Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction – The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid Ordered and Liquid Disordered Phases. Biophysical journal. 107 (5), (2014).
- Pirzer, T., Hugel, T. Adsorption mechanism of polypeptides and their location at hydrophobic interfaces. Chemphyschem. 10 (16), 2795-2799 (2009).
- Butt, H. -. J., Cappella, B., Kappl, M. Force measurements with the atomic force microscope: Technique, interpretation and applications. Surface Science Reports. 59 (1-6), 1-152 (2005).
- Nash, M. A., Gaub, H. E. Single-Molecule Adhesion of a Copolymer to Gold. ACS NANO. 6 (12), 10735-10742 (2012).
- Hermanson, G. . Bioconjugate Techniques. , (1996).
- Kienle, S., et al. Effect of molecular architecture on single polymer adhesion. Langmuir the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (15), 4351-4357 (2014).
- Folkers, J. P., Laibinis, P. E., Whitesides, G. M. Self-assembled monolayers of alkanethiols on gold: comparisons of monolayers containing mixtures of short- and long-chain constituents with methyl and hydroxymethyl terminal groups. Langmuir. 8 (5), 1330-1341 (1995).
- Dankerl, M., et al. Diamond Transistor Array for Extracellular Recording From Electrogenic Cells. Advanced Functional Materials. 19 (18), 2915-2923 (2009).
- Leonenko, Z. V., Carnini, A., Cramb, D. T. Supported planar bilayer formation by vesicle fusion: the interaction of phospholipid vesicles with surfaces and the effect of gramicidin on bilayer properties using atomic force microscopy. Biochimica et biophysica acta. 1509 (1-2), 131-147 (2000).
- Stetter, F. W. S., Hugel, T. The Nanomechanical Properties of Lipid Membranes are Significantly Influenced by the Presence of Ethanol. Biophysical Journal. 104 (5), 1049-1055 (2013).
- Putman, C. A. J., De Grooth, B. G., Hulst, N. F., Greve, J. A detailed analysis of the optical beam deflection technique for use in atomic force microscopy. Journal of Applied Physics. 72 (1), 6-12 (1992).
- Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Review of Scientific Instruments. 64 (7), 1868 (1993).
- Krysiak, S., Liese, S., Netz, R. R., Hugel, T. Peptide desorption kinetics from single molecule force spectroscopy studies. Journal of the American Chemical Society. 136 (2), 688-697 (2014).
- Li, I. T. S., Walker, G. C. Interfacial free energy governs single polystyrene chain collapse in water and aqueous solutions. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6530-6540 (2010).
- Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).
- Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction: The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Phases. Biophysical Journal. 107 (5), 1167-1175 (2014).
- Horinek, D., et al. Peptide adsorption on a hydrophobic surface results from an interplay of solvation, surface, and intrapeptide forces. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (8), 2842-2847 (2008).
- Ebner, A., et al. Functionalization of probe tips and supports for single-molecule recognition force microscopy. Topics in current chemistry. 285 (April), 29-76 (2008).
- Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor. Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).
- Morfill, J., et al. Affinity-matured recombinant antibody fragments analyzed by single-molecule force spectroscopy. Biophysical journal. 93 (10), 3583-3590 (2007).
