Summary

חוקר מולקולה בודדת הדבקה על ידי הכוח האטומי ספקטרוסקופיה

Published: February 27, 2015
doi:

Summary

A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

Abstract

ספקטרוסקופיה כוח האטומית היא כלי אידיאלי ללמוד מולקולות על משטחים וממשקים. פרוטוקול ניסוי לזוג במגוון גדול של מולקולות בודדות קוולנטית על קצה AFM מוצג. באותו הזמן בקצה AFM הוא פסיבציה כדי למנוע אינטראקציות נוקבות בין הקצה ואת המצע, שהוא תנאי הכרחי ללימודי מולקולות בודדות מחוברת לקצה AFM. ניתוח כדי לקבוע את כוח ההידבקות, אורך ההידבקות, ואנרגיה החופשית של מולקולות אלה על משטחים מוצקים וביו-ממשקי זמן קצר הציגו והפניות חיצוניות לקריאה נוספת מסופקות. מולקולות דוגמא הן polytyrosine פולי (חומצת אמינו), פולימר השתל מלק g -PS והאפיפיור פוספוליפידים (1-palmitoyl-2-oleoyl- sn -glycero-3-phosphoethanolamine). מולקולות אלה desorbed ממשטחים שונים כמו CH 3 -SAMs, יהלומי מימן הסתיים ונתמך bilayers שומנים בתנאי ממס שונים. לבסוף,יתרונות של ניסויי מולקולת כוח ספקטרוסקופיות יחידים נדונים לרבות אמצעים כדי להחליט אם באמת מולקולה בודדת נחקרה בניסוי.

Introduction

במהלך 30 השנים האחרונות, במיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) התברר להיות טכניקת הדמיה רבת ערך כדי ללמוד 1,2 וסינתטי 3 חומרים ופני שטח ביולוגיים שכן הוא מספק רזולוציה מרחבית מולקולרית בכל שלושת הממדים ויכול להיות מופעל בממס שונים סביבות. בנוסף, כוח מולקולת ספקטרוסקופיה AFM-הורי (SMFS) מאפשרת למדוד כוחות הנעים בין pN לμN משטר ונתנה תובנות חסרות תקדים לדוגמא לחלבון מתקפלות 4,5, פיזיקת פולימר 6-8, ואינטראקציה מולקולה-משטח אחד 9 – 12 רציונל מאחורי .the לומד מולקולות בודדות ולא הרכב של מולקולות הוא להימנע מממוצע השפעות אשר לעתים קרובות להסוות אירועים נדירים או מדינות מולקולריות מוסתרות. יתר על כן, מספר רב של פרמטרים מולקולריים כגון אורך הגובה, אורך Kuhn, אנרגיה חופשית ההידבקות, וכו 'יכול להיותהושג. זה מפורט בדוגמאות שלהלן. בניסוי AFM-SMFS טיפוסי, מולקולת הבדיקה היא מצמידים את קצה חד מאוד באמצעות מולקולה מקשר. טיפ עצמו נמצא בסוף שלוחה bendable. אם הקצה הוא הביא במגע עם פני השטח מולקולת הבדיקה תהיה אינטראקציה עם פני השטח זה. על ידי התבוננות הסטייה של שלוחה על הכחשה של הקצה, הכוח, ולכן האנרגיה החופשית, כדי לנתק את המולקולה מפני השטח ניתן לקבוע. כדי לקבל נתונים סטטיסטיים משמעותיים, מספר רב של מה שנקראו עקומות כוח למרחקים שיירכש. יתר על כן, יש ניסויי מולקולה בודדת אמיתיים (כלומר, שימוש ובעונה אחת מולקולת בדיקה על משך הניסוי כולו) מולקולת הבדיקה צריכה להיות בשילוב קוולנטית לקצה AFM. כאן, פרוטוקול ניסוי לfunctionalization שלוחה עם מולקולה בודדת באמצעות קשר קוולנטי מוצג. המולקולה בודדת או יכולה להיות בשילוב באמצעות אמינו או thioקבוצת l לקצה AFM. התהליך הצמידה יכול להתבצע במגוון רחב של ממסים (אורגניים ומימיים) כדי להסביר את תכונות solvation של הפולימרים המשמשים.

בחלקו הראשון, פרוטוקול כללי לצרף קוולנטית מולקולה בודדת ("מולקולת בדיקה") באמצעות מולקולת מקשר לקצה AFM מתואר. לשם כך, NHS- האורגני או maleimide-הכימיה משמשת 13. יחד עם הפרוטוקול לשלוש מולקולות דוגמא, תהליכי רכישת נתונים וניתוח נתונים מתוארים ואזכור לקריאה נוספת מסופק. מולקולות הדוגמא הן: טירוזין הפולימר (ליניארי), פולימר השתל מלק g -PS והאפיפיור השומנים. זה כולל שינויים קלים של הפרוטוקול, למשל לצרף קוולנטית cysteines. בנוסף, סעיף מוקדש להכנת משטחים שונים כגון משטח יהלום, 3 monolayer התאספו -self CH וbilayers שומנים. יש לי ממשקים אלה proven להיות אזכור טוב ודוגמאות.

Protocol

הערה: ראה איור 2 לסקירה כללית של זרימת ההליך הכוללת את ההכנה, את צעדי רכישת נתונים וניתוח נתונים. 1. הגדרה מגיב הערה: כל הכימיקלים חייבים להיות מטופל בזהירות, ובכך חלוק מעבדה, יש להשתמש ב…

Representative Results

בחלק הבא, התוצאות עבור מעל מתוארות מולקולות דוגמא, כלומר polytyrosine פולי פולימרים (חומצת אמינו), פולימר השתל מלק g -PS והאפיפיור פוספוליפידים, מוצגים. ראשית לכל דוגמא, להתנסות פרטים ספציפיים לרכישת נתונים והכנת הנתונים מסופקים. לאחר מכן, תוצאות המופת לניסויים שבם מולק?…

Discussion

במהלך העשורים האחרונים, ניסויי מולקולה בודדים סיפקו תובנות חסרות תקדים לתוך מנגנונים מולקולריים והתבררו להיות גישה לא יסולא בפז בתחום מדעי חיים ומעבר. כדי להשיג נתונים סטטיסטיים טובים ומשמעותיים מניסויי SMFS, באופן אידיאלי ובעונה אחת המולקולה משמשת מעל כל מהלך הנ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank the DFG (Hu 997/2-2) for financial support. FS acknowledges the Hanns-Seidel-Stiftung (HSS). SKr was supported by the Elitenetzwerk Bayern in the framework of the doctorate program Material Science of Complex Interfaces. SKi thanks the SFB 863 for financial support.

Materials

Materials
Hellmanex III alkaline liquid concentrate (detergent solution) Hellma
RCA (ultrapure water, hydrogen peroxide (35 %), ammonia (32%); 5:1:1(v/v/v)) Sigma
Vectabond reagent / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane Vectorlabs
Dry acetone (< 50 ppm H2O) Sigma
Dry chloroform (> 99.9 %) Sigma
Triethylamine Sigma
Ultrapure water Biochrom, Germany
Di-sodium tetraborate (> 99.5 %) Biochrom, Germany
Boric Acid Biochrom, Germany
Monofunctional α-methoxy-ω-NHS PEG, 5kDa, “methyl-PEG-NHS” Rapp, Germany
Heterobifunctional α,ω-bis-NHS PEG, 6 kDa, “NHS-PEG-NHS” Rapp, Germany
Heterobifunctional α-maleimidohexanoic- ω-NHS PEG, 5 kDa, “Mal-PEG-NHS” Rapp, Germany
Probe molecule (polymer, lipid, etc.)
Equipment
Sufficient amount of glass crystallising dishes with spout (10 ml), glass petri dishes (500 µl) and glass lids VWR International GmbH, Germany
Laboratory oven model UF30 Memmert, Germany
Temperature controlled sonicator VWR International GmbH, Germany
Plasma system "Femto", 100 W Diener, Germany
One separate glass syringe for each organic solvent VWR International GmbH, Germany
Vortex mixer VWR International GmbH, Germany
Microcentrifuge tubes (0.5 ml or 1.5 ml) Eppendorf
Pipettes: 10-100 µl, 50-200 µl and 100-1000 µl Eppendorf
AFM with temperature controlled fluid cell (e.g. MFP-3D with BioHeater) Asylulm Research, Santa Barbara
Soft SiN cantilevers cantilever, typically made from silicon nitride (SiN) (spring constant less than 100 pN/nm, e.g. MLCT) Bruker AXS, Santa Barbara

References

  1. Scheuring, S., Sapra, K., Müller, D. Probing Single Membrane Proteins by Atomic Force Microscopy. Handbook of Single-Molecule Biophysics. , 449-485 (2009).
  2. Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy. Nature. 468 (7320), 72-76 (2010).
  3. Magonov, S. N. Atomic Force Microscopy in Analysis of Polymers. Encyclopedia of Analytical Chemistry. , (2006).
  4. Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules. Nature Structural Biology. 6 (4), 346-349 (1999).
  5. Li, H., Linke, W. a., et al. Reverse engineering of the giant muscle protein titin. Nature. 418 (6901), 998-1002 (2002).
  6. Bustamante, C., Smith, S. B., Liphardt, J., Smith, D. Single-molecule studies of DNA mechanics. Current opinion in structural biology. 10 (3), 279-285 (2000).
  7. Zhang, W., Zhang, X. Single molecule mechanochemistry of macromolecules. Progress in Polymer Science. 28 (8), 1271-1295 (2003).
  8. Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H., Netz, R. Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory. Physical Review Letters. 94 (4), 048301 (2005).
  9. Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction – The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid Ordered and Liquid Disordered Phases. Biophysical journal. 107 (5), (2014).
  10. Pirzer, T., Hugel, T. Adsorption mechanism of polypeptides and their location at hydrophobic interfaces. Chemphyschem. 10 (16), 2795-2799 (2009).
  11. Butt, H. -. J., Cappella, B., Kappl, M. Force measurements with the atomic force microscope: Technique, interpretation and applications. Surface Science Reports. 59 (1-6), 1-152 (2005).
  12. Nash, M. A., Gaub, H. E. Single-Molecule Adhesion of a Copolymer to Gold. ACS NANO. 6 (12), 10735-10742 (2012).
  13. Hermanson, G. . Bioconjugate Techniques. , (1996).
  14. Kienle, S., et al. Effect of molecular architecture on single polymer adhesion. Langmuir the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (15), 4351-4357 (2014).
  15. Folkers, J. P., Laibinis, P. E., Whitesides, G. M. Self-assembled monolayers of alkanethiols on gold: comparisons of monolayers containing mixtures of short- and long-chain constituents with methyl and hydroxymethyl terminal groups. Langmuir. 8 (5), 1330-1341 (1995).
  16. Dankerl, M., et al. Diamond Transistor Array for Extracellular Recording From Electrogenic Cells. Advanced Functional Materials. 19 (18), 2915-2923 (2009).
  17. Leonenko, Z. V., Carnini, A., Cramb, D. T. Supported planar bilayer formation by vesicle fusion: the interaction of phospholipid vesicles with surfaces and the effect of gramicidin on bilayer properties using atomic force microscopy. Biochimica et biophysica acta. 1509 (1-2), 131-147 (2000).
  18. Stetter, F. W. S., Hugel, T. The Nanomechanical Properties of Lipid Membranes are Significantly Influenced by the Presence of Ethanol. Biophysical Journal. 104 (5), 1049-1055 (2013).
  19. Putman, C. A. J., De Grooth, B. G., Hulst, N. F., Greve, J. A detailed analysis of the optical beam deflection technique for use in atomic force microscopy. Journal of Applied Physics. 72 (1), 6-12 (1992).
  20. Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Review of Scientific Instruments. 64 (7), 1868 (1993).
  21. Krysiak, S., Liese, S., Netz, R. R., Hugel, T. Peptide desorption kinetics from single molecule force spectroscopy studies. Journal of the American Chemical Society. 136 (2), 688-697 (2014).
  22. Li, I. T. S., Walker, G. C. Interfacial free energy governs single polystyrene chain collapse in water and aqueous solutions. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6530-6540 (2010).
  23. Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).
  24. Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction: The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Phases. Biophysical Journal. 107 (5), 1167-1175 (2014).
  25. Horinek, D., et al. Peptide adsorption on a hydrophobic surface results from an interplay of solvation, surface, and intrapeptide forces. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (8), 2842-2847 (2008).
  26. Ebner, A., et al. Functionalization of probe tips and supports for single-molecule recognition force microscopy. Topics in current chemistry. 285 (April), 29-76 (2008).
  27. Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor. Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).
  28. Morfill, J., et al. Affinity-matured recombinant antibody fragments analyzed by single-molecule force spectroscopy. Biophysical journal. 93 (10), 3583-3590 (2007).

Play Video

Cite This Article
Stetter, F. W. S., Kienle, S., Krysiak, S., Hugel, T. Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (96), e52456, doi:10.3791/52456 (2015).

View Video