Untersuchung von Einzelmolekül Haftung durch Rasterkraftspektroskopie
Summary
A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.
Abstract
Rasterkraftspektroskopie ist ein ideales Werkzeug, um Moleküle an Oberflächen und Grenzflächen zu untersuchen. Eine experimentelle Protokoll zum Koppeln eine Vielzahl von Einzelmoleküle kovalent an einer AFM-Spitze dargestellt. Gleichzeitig die AFM-Spitze passiviert, um unspezifische Wechselwirkungen zwischen der Spitze und dem Substrat, die eine Voraussetzung für die einzelnen Moleküle an die AFM-Spitze angebracht studieren verhindern. Analysen, um die Haftkraft, die Haftung der Länge, und die freie Energie dieser Moleküle auf festen Oberflächen und Bio-Schnittstellen werden in Kürze vorgestellt und externe Verweise auf weiterführende Literatur werden zur Verfügung gestellt zu bestimmen. Beispiel Moleküle sind die Poly (aminosäure) Polytyrosin das Pfropfpolymer PI- g -PS und das Phospholipid POPE (1-Palmitoyl-2-oleoyl- sn-glycero-3-phosphoethanolamin). Diese Moleküle werden von verschiedenen Oberflächen wie CH 3 -SAMs, Wasserstoff terminiert Diamant desorbiert und unterstützten Lipiddoppelschichten unter verschiedenen Lösungsbedingungen. Schließlich wird dasVorteile der Kraft-spektroskopische Einzelmolekülexperimenten diskutiert Mittel zu entscheiden, ob wirklich ein einzelnes Molekül hat im Experiment untersucht.
Introduction
In den letzten 30 Jahren ist die Rasterkraftmikroskopie (AFM) sich als ein wertvolles Abbildungstechnik zur biologischen 1,2 und synthetische 3 Materialien und Oberflächen zu untersuchen, da sie Informationen über die Molekular räumliche Auflösung in allen drei Dimensionen und in verschiedenen Lösungsmittel betrieben werden kann Umgebungen. Außerdem AFM-Einzelmolekülkraftspektroskopie (SMFS) ermöglicht, Kräfte, die von der pN-Regime uN messen und hat beispiellose Einblicke beispielsweise in der Proteinfaltung 4,5, Polymerphysik 6 angegeben – 8 und Einzelmolekül-Oberflächen-Wechselwirkung 9 – 12 .Die Gründe für einzelne Moleküle anstatt ein Ensemble von Molekülen ist die Vermeidung von durchschnittlich Effekte, die oft zu maskieren seltene Ereignisse oder versteckte Molekülzustände. Ferner kann eine Vielzahl von molekularen Parameter wie die Konturlänge, die Kuhn Länge der Haft freien Energie, etc.erhalten. Dies wird in den folgenden Beispielen beschrieben. In einem typischen AFM-SMFS-Experiment wird das Sondenmolekül zu einer sehr scharfen Spitze über ein Linkermolekül gekoppelt. Die Spitze selbst ist am Ende eines biegbaren Ausleger angeordnet. Wenn die Spitze in Berührung mit der Oberfläche gebracht wird das Sondenmolekül wird mit dieser Oberfläche in Wechselwirkung treten. Durch die Beobachtung der Auslenkung des Auslegers beim Zurückziehen der Spitze, die Kraft und damit die freie Energie, um das Molekül von der Oberfläche ablösen kann bestimmt werden. Um aussagekräftige Statistiken zu erhalten, wurde eine Vielzahl von so genannten Kraft-Weg-Kurven aufgenommen werden. Ferner sind echte Einzelmolekülexperimente (dh, mit ein und derselben Sonde Moleküls über die Dauer des gesamten Experiments) das Sondenmolekül sollte kovalent an die AFM-Spitze gekoppelt werden müssen. Hier wird ein Versuchsprotokoll für Cantilever Funktionalisierung mit einem einzelnen Molekül über eine kovalente Bindung dargestellt. Die einzigen Molekül kann entweder über eine Amino- oder eine Thio gekoppelt werdenl-Gruppe an die AFM-Spitze. Die Konjugation Verfahren kann in einer Vielzahl von Lösungsmitteln (organisch und wässrig), um für die Lösungseigenschaften der verwendeten Polymere Konto erfolgen.
Im ersten Teil, ein allgemeines Protokoll, um kovalent an ein einzelnes Molekül ("Sondenmolekül") über ein Linkermolekül an eine AFM-Spitze beschrieben. Zu diesem Zweck wird organischen NHS- oder Maleimid-Chemie verwendet 13. Zusammen mit dem Protokoll für die drei beispielhaften Molekülen, werden die Datenerfassung und Datenanalyseverfahren beschrieben, und Literaturhinweise sind. Die Beispiel-Moleküle sind: die (lineare) Polymer Tyrosin, das Pfropfpolymerisat PI- g -PS und die Lipid PAPST. Dies beinhaltet leichte Variationen des Protokolls, zum Beispiel kovalente Anbindung Cysteine. Zusätzlich ist ein Abschnitt, um die Herstellung von verschiedenen Oberflächen wie einer Diamantoberfläche, einer CH 3 -tafeln organisierte Monoschicht und Lipiddoppelschichten gewidmet. Diese Schnittstellen müssen proven, um gute Referenzen und Beispiele können.
Protocol
Representative Results
Discussion
In den letzten Jahrzehnten haben die Einzelmolekül-Experimente beispiellose Einblicke in die molekularen Mechanismen, die zur Verfügung gestellt und erwies sich als ein wertvolles Vorgehen im Bereich Life Science und darüber hinaus. Um eine gute und sinn Statistiken EMKS Experimenten idealer ein und dasselbe Molekül wird über den gesamten Verlauf des Experiments verwendet erzielen. Im Gegensatz zu den Experimenten mit Ensembles von Molekülen sind SMFS Experimente in der Lage, seltene Ereignisse und versteckt Molek…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the DFG (Hu 997/2-2) for financial support. FS acknowledges the Hanns-Seidel-Stiftung (HSS). SKr was supported by the Elitenetzwerk Bayern in the framework of the doctorate program Material Science of Complex Interfaces. SKi thanks the SFB 863 for financial support.
Materials
| Materials | |||
| Hellmanex III alkaline liquid concentrate (detergent solution) | Hellma | ||
| RCA (ultrapure water, hydrogen peroxide (35 %), ammonia (32%); 5:1:1(v/v/v)) | Sigma | ||
| Vectabond reagent / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Vectorlabs | ||
| Dry acetone (< 50 ppm H2O) | Sigma | ||
| Dry chloroform (> 99.9 %) | Sigma | ||
| Triethylamine | Sigma | ||
| Ultrapure water | Biochrom, Germany | ||
| Di-sodium tetraborate (> 99.5 %) | Biochrom, Germany | ||
| Boric Acid | Biochrom, Germany | ||
| Monofunctional α-methoxy-ω-NHS PEG, 5kDa, “methyl-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α,ω-bis-NHS PEG, 6 kDa, “NHS-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α-maleimidohexanoic- ω-NHS PEG, 5 kDa, “Mal-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Probe molecule (polymer, lipid, etc.) | |||
| Equipment | |||
| Sufficient amount of glass crystallising dishes with spout (10 ml), glass petri dishes (500 µl) and glass lids | VWR International GmbH, Germany | ||
| Laboratory oven model UF30 | Memmert, Germany | ||
| Temperature controlled sonicator | VWR International GmbH, Germany | ||
| Plasma system "Femto", 100 W | Diener, Germany | ||
| One separate glass syringe for each organic solvent | VWR International GmbH, Germany | ||
| Vortex mixer | VWR International GmbH, Germany | ||
| Microcentrifuge tubes (0.5 ml or 1.5 ml) | Eppendorf | ||
| Pipettes: 10-100 µl, 50-200 µl and 100-1000 µl | Eppendorf | ||
| AFM with temperature controlled fluid cell (e.g. MFP-3D with BioHeater) | Asylulm Research, Santa Barbara | ||
| Soft SiN cantilevers cantilever, typically made from silicon nitride (SiN) (spring constant less than 100 pN/nm, e.g. MLCT) | Bruker AXS, Santa Barbara |
References
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