Summary

Investigando única molécula de adesão de Força Atômica Spectroscopy

Published: February 27, 2015
doi:

Summary

A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

Abstract

Espectroscopia de força atômica é uma ferramenta ideal para estudar moléculas em superfícies e interfaces. Um protocolo experimental para acoplar uma grande variedade de moléculas individuais de forma covalente para uma ponta de AFM é apresentado. Ao mesmo tempo, a ponta de AFM é passivado para evitar interacções não específicas entre a ponta e o substrato, o que é um pré-requisito para estudar moléculas individuais ligados à ponta de AFM. As análises para determinar a força de adesão, o comprimento de aderência, e a energia livre destas moléculas em superfícies sólidas e bio-interfaces são pouco apresentados e referências externas para leitura são fornecidos. Exemplos são as moléculas a polytyrosine poli (aminoácidos), o polímero de enxerto PI- g -PS e o PAPA fosfolípido (1-palmitoil-2-oleoyl–sn-glicero-3-fosfoetanolamina). Estas moléculas são dessorvida a partir de diferentes superfícies como CH 3 -SAMs, hidrogénio terminada diamante e suportado bicamadas lipídicas sob várias condições do solvente. Finalmente, ovantagens da força espectroscópicas experiências de moléculas individuais são discutidas, incluindo meios para decidir se verdadeiramente uma única molécula tem sido estudada no experimento.

Introduction

Ao longo dos últimos 30 anos, microscopia de força atômica (AFM) acabou por ser uma técnica valiosa imagem para estudar biológicos 1,2 e sintéticas 3 materiais e superfícies, uma vez que fornece resolução espacial molecular em todas as três dimensões e pode ser operado em vários solvente ambientes. Além disso, a força molécula espectroscopia AFM-single (SMFS) permite medir forças que vão desde o PN a μN regime e deu uma visão sem precedentes por exemplo em proteína dobrar 4,5, física polímero 6-8, e interação molécula de superfície única 9 – 12 .A lógica por trás estudar moléculas individuais, em vez de um conjunto de moléculas é para evitar efeitos que muitas vezes mascaram eventos raros ou estados moleculares escondidos em média. Além disso, um grande número de parâmetros moleculares, tais como o comprimento do contorno, o comprimento Kuhn, a energia livre de adesão, etc., podem serobtida. Este é detalhado nos exemplos abaixo. Numa experiência típica AFM-SMFS, a molécula de sonda é acoplada a uma ponta muito afiada através de uma molécula ligante. A ponta em si está localizado na extremidade de um braço de suporte flexível. Se a ponta é colocada em contacto com a superfície da molécula de sonda irá interagir com esta superfície. Observando-se a deflexão do braço de suporte à retracção da ponta, a força, e, por conseguinte, a energia livre, para separar a molécula de superfície pode ser determinada. Para obter estatísticas significativas, um grande número de chamadas curvas força-distância tem que ser adquirido. Além disso, para ter verdadeiros experimentos única molécula (isto é, utilizando uma e a mesma molécula sonda ao longo da duração de todo o experimento) a molécula sonda deve ser acoplado de forma covalente à ponta de AFM. Aqui, um protocolo experimental para a funcionalização cantilever com uma única molécula através de uma ligação covalente é apresentado. A única molécula ou pode ser acoplada por via de um grupo amino ou um tiol grupo para a ponta do AFM. O processo de conjugação pode ser realizada numa ampla variedade de solventes orgânicos e aquosos () para ter em conta as propriedades de solvatação dos polímeros usados.

Na primeira parte, um protocolo geral para ligar covalentemente uma molécula única ("molécula sonda") através de uma molécula ligante de uma ponta de AFM é descrito. Para este fim, NHS- orgânico ou maleimida-química é utilizado 13. Junto com o protocolo por três moléculas de exemplo, os processos de aquisição de dados e análise de dados são descritos e referências para leitura são fornecidos. Os exemplos de moléculas são: o (linear) tirosina polímero, o polímero de enxerto PI- g -PS e o PAPA lipídica. Isto inclui ligeiras variações do protocolo, por exemplo, para ligar covalentemente cisteínas. Além disso, uma secção dedicada à preparação de superfícies diferentes, tais como uma superfície de diamante, um CH3 montado -auto-monocamada e bicamadas lipídicas. Essas interfaces tem proven ser boas referências e exemplos.

Protocol

NOTA: Consulte a Figura 2 para uma visão geral do fluxo do processo que compreende a preparação, as etapas de aquisição de dados e análise de dados. 1. Instalação do Reagente NOTA: Todos os produtos químicos devem ser manuseados com cuidado, e, portanto, um jaleco, luvas e proteção para os olhos devem ser usados. Todas as operações devem ser realizadas numa hote de laboratório. Em particular, as luvas especiais devem ser usados ​​…

Representative Results

No que se segue, os resultados para o exemplo acima descrito, ou seja, a moléculas polytyrosine polímeros de poli (aminoácidos), o polímero de enxerto PI- g -PS e o PAPA fosfolípido, são apresentados. Primeiro para cada exemplo, experimentar detalhes específicos para a aquisição de dados e preparação de dados são fornecidos. Em seguida, os resultados exemplares para experimentos onde essas moléculas foram dessorvidas de superfícies diferentes (CH3 -SAMs, hidrogênio encerrado diamante e…

Discussion

Durante as últimas décadas, os experimentos única molécula ter fornecido informações sem precedentes sobre mecanismos moleculares e acabou por ser uma abordagem de valor inestimável em ciências da vida e além. Para alcançar bons e estatísticas significativas de experiências SMFS, de preferência uma e a mesma molécula é usado ao longo de todo o decurso da experiência. Em contraste com as experiências com conjuntos de moléculas, as experiências SMFS são capazes de detectar eventos raros e estados molec…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank the DFG (Hu 997/2-2) for financial support. FS acknowledges the Hanns-Seidel-Stiftung (HSS). SKr was supported by the Elitenetzwerk Bayern in the framework of the doctorate program Material Science of Complex Interfaces. SKi thanks the SFB 863 for financial support.

Materials

Materials
Hellmanex III alkaline liquid concentrate (detergent solution) Hellma
RCA (ultrapure water, hydrogen peroxide (35 %), ammonia (32%); 5:1:1(v/v/v)) Sigma
Vectabond reagent / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane Vectorlabs
Dry acetone (< 50 ppm H2O) Sigma
Dry chloroform (> 99.9 %) Sigma
Triethylamine Sigma
Ultrapure water Biochrom, Germany
Di-sodium tetraborate (> 99.5 %) Biochrom, Germany
Boric Acid Biochrom, Germany
Monofunctional α-methoxy-ω-NHS PEG, 5kDa, “methyl-PEG-NHS” Rapp, Germany
Heterobifunctional α,ω-bis-NHS PEG, 6 kDa, “NHS-PEG-NHS” Rapp, Germany
Heterobifunctional α-maleimidohexanoic- ω-NHS PEG, 5 kDa, “Mal-PEG-NHS” Rapp, Germany
Probe molecule (polymer, lipid, etc.)
Equipment
Sufficient amount of glass crystallising dishes with spout (10 ml), glass petri dishes (500 µl) and glass lids VWR International GmbH, Germany
Laboratory oven model UF30 Memmert, Germany
Temperature controlled sonicator VWR International GmbH, Germany
Plasma system "Femto", 100 W Diener, Germany
One separate glass syringe for each organic solvent VWR International GmbH, Germany
Vortex mixer VWR International GmbH, Germany
Microcentrifuge tubes (0.5 ml or 1.5 ml) Eppendorf
Pipettes: 10-100 µl, 50-200 µl and 100-1000 µl Eppendorf
AFM with temperature controlled fluid cell (e.g. MFP-3D with BioHeater) Asylulm Research, Santa Barbara
Soft SiN cantilevers cantilever, typically made from silicon nitride (SiN) (spring constant less than 100 pN/nm, e.g. MLCT) Bruker AXS, Santa Barbara

References

  1. Scheuring, S., Sapra, K., Müller, D. Probing Single Membrane Proteins by Atomic Force Microscopy. Handbook of Single-Molecule Biophysics. , 449-485 (2009).
  2. Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy. Nature. 468 (7320), 72-76 (2010).
  3. Magonov, S. N. Atomic Force Microscopy in Analysis of Polymers. Encyclopedia of Analytical Chemistry. , (2006).
  4. Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules. Nature Structural Biology. 6 (4), 346-349 (1999).
  5. Li, H., Linke, W. a., et al. Reverse engineering of the giant muscle protein titin. Nature. 418 (6901), 998-1002 (2002).
  6. Bustamante, C., Smith, S. B., Liphardt, J., Smith, D. Single-molecule studies of DNA mechanics. Current opinion in structural biology. 10 (3), 279-285 (2000).
  7. Zhang, W., Zhang, X. Single molecule mechanochemistry of macromolecules. Progress in Polymer Science. 28 (8), 1271-1295 (2003).
  8. Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H., Netz, R. Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory. Physical Review Letters. 94 (4), 048301 (2005).
  9. Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction – The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid Ordered and Liquid Disordered Phases. Biophysical journal. 107 (5), (2014).
  10. Pirzer, T., Hugel, T. Adsorption mechanism of polypeptides and their location at hydrophobic interfaces. Chemphyschem. 10 (16), 2795-2799 (2009).
  11. Butt, H. -. J., Cappella, B., Kappl, M. Force measurements with the atomic force microscope: Technique, interpretation and applications. Surface Science Reports. 59 (1-6), 1-152 (2005).
  12. Nash, M. A., Gaub, H. E. Single-Molecule Adhesion of a Copolymer to Gold. ACS NANO. 6 (12), 10735-10742 (2012).
  13. Hermanson, G. . Bioconjugate Techniques. , (1996).
  14. Kienle, S., et al. Effect of molecular architecture on single polymer adhesion. Langmuir the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (15), 4351-4357 (2014).
  15. Folkers, J. P., Laibinis, P. E., Whitesides, G. M. Self-assembled monolayers of alkanethiols on gold: comparisons of monolayers containing mixtures of short- and long-chain constituents with methyl and hydroxymethyl terminal groups. Langmuir. 8 (5), 1330-1341 (1995).
  16. Dankerl, M., et al. Diamond Transistor Array for Extracellular Recording From Electrogenic Cells. Advanced Functional Materials. 19 (18), 2915-2923 (2009).
  17. Leonenko, Z. V., Carnini, A., Cramb, D. T. Supported planar bilayer formation by vesicle fusion: the interaction of phospholipid vesicles with surfaces and the effect of gramicidin on bilayer properties using atomic force microscopy. Biochimica et biophysica acta. 1509 (1-2), 131-147 (2000).
  18. Stetter, F. W. S., Hugel, T. The Nanomechanical Properties of Lipid Membranes are Significantly Influenced by the Presence of Ethanol. Biophysical Journal. 104 (5), 1049-1055 (2013).
  19. Putman, C. A. J., De Grooth, B. G., Hulst, N. F., Greve, J. A detailed analysis of the optical beam deflection technique for use in atomic force microscopy. Journal of Applied Physics. 72 (1), 6-12 (1992).
  20. Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Review of Scientific Instruments. 64 (7), 1868 (1993).
  21. Krysiak, S., Liese, S., Netz, R. R., Hugel, T. Peptide desorption kinetics from single molecule force spectroscopy studies. Journal of the American Chemical Society. 136 (2), 688-697 (2014).
  22. Li, I. T. S., Walker, G. C. Interfacial free energy governs single polystyrene chain collapse in water and aqueous solutions. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6530-6540 (2010).
  23. Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).
  24. Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction: The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Phases. Biophysical Journal. 107 (5), 1167-1175 (2014).
  25. Horinek, D., et al. Peptide adsorption on a hydrophobic surface results from an interplay of solvation, surface, and intrapeptide forces. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (8), 2842-2847 (2008).
  26. Ebner, A., et al. Functionalization of probe tips and supports for single-molecule recognition force microscopy. Topics in current chemistry. 285 (April), 29-76 (2008).
  27. Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor. Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).
  28. Morfill, J., et al. Affinity-matured recombinant antibody fragments analyzed by single-molecule force spectroscopy. Biophysical journal. 93 (10), 3583-3590 (2007).

Play Video

Cite This Article
Stetter, F. W. S., Kienle, S., Krysiak, S., Hugel, T. Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (96), e52456, doi:10.3791/52456 (2015).

View Video