التصوير المحلية الكالسيوم<sup> 2+</sup> الإشارات في خلايا الثدييات مثقف
Summary
Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.
Abstract
عصاري خلوي كا 2+ أيونات تنظم جوانب عديدة من النشاط الخلوي في جميع أنواع الخلايا تقريبا، والعمليات كما واسع النطاق كما النسخ الجيني، استثارة الكهربائية وتكاثر الخلايا السيطرة. تنوع وخصوصية الكالسيوم 2+ إشارات مستمد من الآليات التي يتم إنشاؤها الكالسيوم 2+ إشارات للعمل على نطاقات زمنية ومكانية مختلفة، بدءا من التذبذبات على مستوى الخلية وموجات تحدث خلال فترات دقيقة لمحلية عابرة الكالسيوم 2+ microdomains (الكالسيوم 2+ نفث) ميلي ثانية دائمة. تضاعفت التطورات الحديثة في الإلكترون CCD (EMCCD) الكاميرات تسمح الآن للتصوير من الكالسيوم المحلية 2+ الإشارات مع قرار المكاني 128 × 128 بكسل وفقا لأسعار> 500 لقطة في الثانية -1 (إطارا في الثانية). هذا النهج هو مواز للغاية ويمكن رصد في وقت واحد من مئات القنوات أو المواقع نفخة في تجربة واحدة. ومع ذلك، فإن كميات هائلة من البيانات ولدت (حوالي 1 غيغابايت بيص دقيقة) تجعل التعرف البصري وتحليل الكالسيوم المحلي 2+ الأحداث عملي. نحن هنا وصف وشرح إجراءات الاستحواذ، والكشف، وتحليل IP المحلي 3 بوساطة الكالسيوم 2+ الإشارات في خلايا الثدييات سليمة محملة الكالسيوم 2+ المؤشرات باستخدام كل واسعة المجال برنامج التحصين الموسع ومضان (WF) والانعكاس الكلي الداخلي مضان (TIRF) المجهري. وعلاوة على ذلك، نحن تصف خوارزمية وضعت داخل المصدر المفتوح البرمجيات بيثون البيئة بأتمتة تحديد وتحليل هذه الكالسيوم 2+ إشارات المحلية. الخوارزمية يموضع مواقع الكالسيوم 2+ الإفراج لقرار الفرعي بكسل. يسمح للمستخدم باستعراض البيانات؛ والنواتج متواليات وقت إشارات نسبة مضان جنبا إلى جنب مع السعة والبيانات الحركية في جدول Excel متوافق مع.
Introduction
أيونات الكالسيوم (الكالسيوم 2+) تنظيم بتواجد مطلق مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية، بما في ذلك التعبير الجيني، إفراز وتغييرات طويلة الأمد في اللدونة متشابك 1. طريقة واحدة يمكن من خلالها الكالسيوم 2+ يمكن أن تعمل بطريقة مختلفة يتم من خلال أنماط المكانية والزمانية مختلفة من الكالسيوم 2+ اشارات يمكن خلية تولد. على سبيل المثال الارتفاعات العالمية في عصاري خلوي [كا 2+] انكماش الزناد في أنسجة العضلات الملساء 2 في حين أن أصغر، ارتفاعات عابرة مترجم (المحلية الكالسيوم 2+ microdomains) تحفيز التعبير الجيني أساسي للتعلم والذاكرة 3.
عصاري خلوي مجانا [كا 2+] هو الحفاظ على ~ 100 نانومتر في بقية، ولكن يمكن أن يرتفع بسرعة لعدة الجزئي الضرس في أعقاب تدفق الكالسيوم 2+ في العصارة الخلوية من خلال الكالسيوم 2+ القنوات الأيونية -permeable الموجود في غشاء البلازما والتي تحرير الكالسيوم 2+ من الصورة داخل الخلاياTORES. يركز مختبرنا على إينوزيتول 1،4،5-trisphosphate مستقبلات (IP 3 R)، الذي يشكل الكالسيوم 2+ قناة الإفراج الموجود في غشاء الشبكة الإندوبلازمية (ER). على ملزمة لكلا IP 3 والكالسيوم 2+ إلى عصاري خلوي تفعيل مواقع مستقبلات، تفتح R قناة IP 3 لتحرير الكالسيوم 2+ المحتبسة داخل التجويف ER. الافراج عن الكالسيوم 2+ قد تبقى مقيدة مكانيا لمجموعة صغيرة من IP 3 روبية لتوليد microdomain عصاري خلوي المحلية من الكالسيوم 2+ (كاليفورنيا 2+ نفخة 4) أو، اعتمادا على قربها من التجمعات المجاورة IP 3 روبية، قد نشر عبر خلية من خلال تجنيد مواقع نفخة متعددة من خلال عملية الكالسيوم 2+ يسببها الكالسيوم 2+ -release (CICR) 5،6.
إدخال الأصباغ مؤشر جزيء صغير الفلورسنت الكالسيوم 2+ التي وضعتها روجر تسين 7، إلى جانب متقدمة المجهري imagi تقنيات نانوغرام، سهلت بشكل كبير فهمنا من الكالسيوم 2+ الإشارات. التطورات الحديثة في الكاميرات المستخدمة للفحص المجهري يسمح الآن لتصوير عابرة المحلية الكالسيوم 2+ أحداث مثل نفث مع القرار المكانية والزمانية لم يسبق له مثيل. المتاحة حاليا الكاميرات EMCCD تمكن التصوير مع 128 × 128 بكسل في> 500 لقطة في الثانية -1 (FPS) والجيل الجديد من مكمل معدن أكسيد أشباه الموصلات توفر (CMOS) كاميرات دقة أعلى بكسل، وحتى سرعة أكبر على حساب ارتفاع طفيف مستويات الضوضاء. بالتعاون مع الانعكاس الكلي الداخلي (TIRF) المجهري أصبح من الممكن الآن أن صورة واحدة الكالسيوم 2+ أحداث قناة 8،9. هذا النهج يتيح للتصوير المئات من القنوات / الأحداث في وقت واحد، في حين توليد مجموعات البيانات الكبيرة (حوالي 1GB لكل دقيقة) التي تجعل المعالجة اليدوية، وتحديد البصرية والتحليل غير عملي ووضع المسؤولية على عاتق تطوير خوارزميات الآلي.
<p clasالصورة = "jove_content"> هنا، نقدم إجراءات وبروتوكولات لتصوير المحلية الكالسيوم 2+ الإشارات في خلايا الثدييات سليمة باستخدام الكالسيوم الفلورسنت 2+ المؤشرات. علينا أن نظهر المزيد من خوارزمية وضعت في بيئة بيثون المصدر المفتوح بأتمتة تحديد وتحليل المحلية الكالسيوم 2+ الأحداث المصورة من قبل كل من TIRF والتقليدية مجالا واسعا برنامج التحصين الموسع ومضان (WF) المجهري. على الرغم من أن وصفنا هذه النهج في سياق IP 3 -generated الكالسيوم 2+ إشارات، فهي قابلة بسهولة لدراسة التغيرات المحلية في عصاري خلوي [كا 2+] المنبثقة عن مجموعة متنوعة من الكالسيوم 2+ القنوات الأيونية -permeable تقع في أي سطح غشاء أو عضيات داخل الخلايا 8-10.Protocol
Representative Results
Discussion
نحن هنا وصف البروتوكولات لتصوير المحلية الكالسيوم 2+ الأحداث في خلايا الثدييات مثقف باستخدام الكالسيوم الفلورسنت 2+ المؤشرات. وعلاوة على ذلك، نحن تصف خوارزمية مع واجهة مستخدم بديهية بأتمتة تحديد وتحليل البيانات التي حصل عليها. الإجراء الموضح هنا الاستفا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health grants GM 100201 to I.F.S, and GM 048071 and GM 065830 to I.P.
Materials
| Name | Company | Catalogue No. |
| Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells | ATCC | CRL-2266 |
| Cal-520/AM | AAT Bioquest Inc. | 21130 |
| ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4.5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 145-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl) | SiChem | cag-iso-2-145-10 |
| DMSO/20% pluronic F127 | Invitrogen | P-3000MP |
| EGTA/AM | Invitrogen | E-1219 |
| 35 mm glass-bottom imaging dishes | MatTek | P35-1.5-14-C |
References
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
- Hill-Eubanks, D. C., Werner, M. E., Heppner, T. J., Nelson, M. T. Calcium signaling in smooth muscle. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (9), a004549 (2011).
- Hagenston, A. M., Bading, H. Calcium signaling in synapse-to-nucleus communication. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), a004564 (2011).
- Berridge, M. J. Elementary and global aspects of calcium signalling. J Physiol. 499 (Pt 2), 291-306 (1997).
- Lipp, P., Niggli, E. A hierarchical concept of cellular and subcellular calcium signalling). Prog Biophys Mol Biol. 65 (3), 265-296 (1996).
- Parker, I., Yao, Y., Ilyin, V. Fast kinetics of calcium liberation induced in Xenopus oocytes by photoreleased inositol trisphosphate. Biophys J. 70 (1), 222-237 (1996).
- Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores. J Biol Chem. 264 (14), 8171-8178 (1989).
- Demuro, A., Parker, I. Imaging the activity and localization of single voltage-gated Ca(2+) channels by total internal reflection fluorescence microscopy. Biophys J. 86 (5), 3250-3259 (2004).
- Smith, I. F., Parker, I. Imaging the quantal substructure of single inositol trisphosphate receptor channel activity during calcium puffs in intact mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (15), 6404-6409 (2009).
- Reissner, K. J., et al. A novel postsynaptic mechanism for heterosynaptic sharing of short-term plasticity. J Neurosci. 30 (26), 8797-8806 (2010).
- Ellefson, K. S., Parker, B., Smith, I., F, I. An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging. Cell Calcium. , (2014).
- Smith, I. F., Wiltgen, S. M., Parker, I. Localization of puff sites adjacent to the plasma membrane: Functional and spatial characterization of calcium signaling in SH-SY5Y cells utilizing membrane-permeant caged inositol trisphosphate. Cell Calcium. 45, 65-76 (2009).
- Shuai, J., Parker, I. Optical single-channel recording by imaging calcium flux through individual ion channels: theoretical considerations and limits to resolution. Cell Calcium. 37 (4), 283-299 (2005).
