Imagen Ca Local^{2 +} Las señales en las células de mamífero en cultivo

Summary

Here we present techniques for imaging local IP₃-mediated Ca²⁺ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca²⁺ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Abstract

Citosólica iones Ca2 ⁺ a regular diversos aspectos de la actividad celular en casi todos los tipos de células, el control de procesos tan diversos como la transcripción de genes, excitabilidad eléctrica y la proliferación celular. La diversidad y la especificidad de la señalización de Ca2 ⁺ se deriva de mecanismos por los que Ca ^{2 +} señales se generan para actuar sobre diferentes escalas de tiempo y espaciales, que van desde las oscilaciones y las ondas de todo el celulares que ocurren durante los períodos de minutos a locales transitorias de Ca2 ⁺ microdominios (Ca ²⁺⁾ bocanadas milisegundos duraderos. Los recientes avances en electrónica se multiplicaron CCD (EMCCD) cámaras permiten ahora para obtener imágenes de Ca ^{2 +} señales locales con una resolución espacial de 128 x 128 píxeles a una velocidad de> 500 marcos ^seg-1 (fps). Este enfoque es altamente paralelo y permite la monitorización simultánea de cientos de canales o de los sitios de hojaldre en un solo experimento. Sin embargo, las grandes cantidades de datos generados (aproximadamente 1 pe Gbr min) hacer la identificación visual y análisis de Ca ²⁺ local de eventos impracticable. Aquí describimos y demostrar los procedimientos para la adquisición, la detección y el análisis de IP local ₃ mediada por Ca ^{2 +} señales en células de mamífero intactas cargadas de Ca ²⁺ indicadores utilizando tanto de campo amplio epi-fluorescencia (WF) y la reflexión interna total fluorescencia (TIRF) microscopía. Además, se describe un algoritmo desarrollado en el entorno Python software de código abierto que automatiza la identificación y el análisis de estos Ca ^{2 +} señales locales. El algoritmo localiza sitios de liberación de Ca2 ⁺ con resolución sub-pixel; permite la revisión de los datos de usuario; y emite secuencias de tiempo de señales de relación de fluorescencia junto con amplitud y datos cinéticos en una tabla compatible con Excel.

Introduction

Los iones de calcio (Ca2 ⁺⁾ de forma ubicua regulan una amplia gama de procesos biológicos, incluyendo la expresión génica, la secreción y cambios de larga duración en la plasticidad sináptica ^1. Una manera a través del cual Ca ²⁺ puede actuar de una manera tan diverso es a través de los diferentes patrones espaciales y temporales de Ca ^{2 +} señales de una célula puede generar. Por ejemplo, elevaciones globales en citosólico [Ca ^{2 +]} contracción de activación en el tejido muscular liso ^2, mientras más pequeño, elevaciones transitorias localizadas (locales Ca ²⁺ microdominios) estimular la expresión esencial para el aprendizaje y la memoria ³ gen.

Citosólico libre [Ca ^{2 +]} se mantiene a ~ 100 nM en reposo, pero puede aumentar rápidamente a varios micro-molar después de la afluencia de Ca2 ⁺ en el citosol a través de canales de Ca2 ⁺ de iones permeables situados en la membrana plasmática y por la liberación de Ca2 ⁺ intracelular de stores. Nuestro laboratorio se centra en el inositol 1,4,5-trifosfato receptor (IP ₃ R), que forma un canal de liberación de Ca ²⁺ situado en la membrana del retículo endoplasmático (ER). Tras la unión de ambos IP ₃ y Ca ²⁺ a la citosólica sitios del receptor activador, el canal R IP ₃ se abre para liberar Ca ²⁺ secuestrado dentro de la luz del RE. La liberación de Ca ²⁺ puede permanecer espacialmente restringida a un pequeño grupo de IP ₃ Rs para generar un microdomain citosólica local del Ca ²⁺ (Ca ²⁺ puff ⁴⁾ o, dependiendo de la proximidad de los grupos vecinos de IP ₃ Rs, puede propagar en una célula mediante la contratación de varios sitios de hojaldre a través de un proceso de Ca2 ⁺ inducida por Ca ^{2 + de liberación} (CICR) ^5,6.

La introducción de la pequeña molécula fluorescente Ca ²⁺ colorantes indicadores desarrollado por Roger Tsien ^7, junto con la avanzada imagi microscopíang técnicas, ha facilitado en gran medida nuestra comprensión de Ca ^{2 +} señalización. Los recientes avances en cámaras utilizadas para microscopía permiten ahora para obtener imágenes de transitorios de Ca2 ⁺ eventos locales, tales como soplos con resolución espacial y temporal sin precedentes. Actualmente cámaras EMCCD disponibles permiten imágenes de 128 x 128 píxeles a> 500 marcos seg ^-1 (fps) y la nueva generación de semiconductor de óxido metálico complementario (CMOS) cámaras proporcionan una mayor resolución de píxeles, y la velocidad aún más rápida a costa de un poco más alto los niveles de ruido. En conjunción con la reflexión interna (TIRF) microscopía total, ahora es posible de una sola imagen Ca ²⁺ eventos de canal ^8,9. Este enfoque permite la obtención de imágenes de cientos de canales / eventos simultáneamente, mientras que la generación de grandes conjuntos de datos (ca. 1Gb por minuto) que hacen que el tratamiento manual, la identificación visual y análisis impracticable y colocan una responsabilidad en el desarrollo de algoritmos automatizados.

<p class = "jove_content"> A continuación, presentamos los procedimientos y protocolos para la formación de imágenes locales Ca ^{2 +} señales en células de mamífero intactas usando Ca ²⁺ indicadores fluorescentes. Además, demuestran un algoritmo desarrollado en el entorno Python de código abierto que automatiza la identificación y el análisis de Ca ²⁺ eventos locales fotografiados por tanto TIRF y amplio campo epi-fluorescencia convencional (WF) microscopía. Aunque estos enfoques se describen en el contexto de IP ₃ -generated Ca ^{2 +} señales, que son fácilmente susceptibles de estudiar los cambios locales en citosólico [Ca ^{2 +]} que emanan de una variedad de canales de Ca2 ⁺ de iones permeables situados en cualquiera de la superficie membrana o orgánulos intracelulares ^8-10.

Protocol

Presentamos los procedimientos detallados para obtener imágenes locales de Ca2 + eventos en neuroblastoma humano SH-SY5Y células. Estos procedimientos pueden ser adaptados a la imagen intracelular de Ca 2 + señales en muchos tipos de células 8-10. 1. Preparación de las células Cultura de las células para obtener imágenes de acuerdo a las instrucciones que aparecen en la página web de su proveedor. Unos pocos días antes de la ima…

Representative Results

La figura 1A muestra una imagen WF de descansar Cal-520 fluorescencia en células de neuroblastoma humano SH-SY5Y también cargados de ci-IP 3. La exposición de estas células a un flash 100 ms UV para foto-release i-IP 3 provocó transitorios de Ca2 + puffs en sitios discretos (señaladas por los círculos blancos en la figura 1A). Trazas fluorescencia medida en estos sitios mostraron una fase ascendente rápido debido a las aberturas transitorios de I…

Discussion

Describimos aquí los protocolos locales para obtener imágenes de Ca ²⁺ eventos en células de mamífero en cultivo usando Ca ²⁺ indicadores fluorescentes. Además, se describe un algoritmo con una interfaz de usuario intuitiva que automatiza la identificación y análisis de los datos adquiridos. El procedimiento descrito aquí utilizan el Ca ²⁺ fluorescente indicador Cal-520, pero muchas otras Ca ²⁺ tintes sensibles como Fluo-3, Fluo-4, Fluo-8 y Oregon Green BAPTA-1 realiza…

Materials

Name	Company	Catalogue No.
Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells	ATCC	CRL-2266
Cal-520/AM	AAT Bioquest Inc.	21130
ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4.5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 145-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl)	SiChem	cag-iso-2-145-10
DMSO/20% pluronic F127	Invitrogen	P-3000MP
EGTA/AM	Invitrogen	E-1219
35 mm glass-bottom imaging dishes	MatTek	P35-1.5-14-C