Imagerie Ca locale²⁺ Signaux de cellules de mammifères cultivées

Summary

Here we present techniques for imaging local IP₃-mediated Ca²⁺ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca²⁺ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Abstract

Cytosolique ions Ca ²⁺ réglementer de nombreux aspects de l'activité cellulaire dans presque tous les types de cellules, le contrôle des processus aussi variés que la transcription des gènes, excitabilité électrique et la prolifération cellulaire. La diversité et la spécificité de Ca ²⁺ signalisation dérive de mécanismes par lesquels Ca ²⁺ signaux sont générés pour agir sur des échelles de temps et d'espace différentes, allant des oscillations et des vagues large cellulaires survenant au cours des périodes de minutes à transitoires ^{Ca2 +} microdomaines locales (Ca ²⁺⁾ bouffées millisecondes durables. Les progrès récents dans électrons multipliés CCD (EMCCD) caméras permettent désormais pour l'imagerie des signaux Ca ²⁺ locaux avec une résolution spatiale de 128 x 128 pixels à des taux de> 500 cadres sec ^-1 (fps). Cette approche est très parallèle et permet la surveillance simultanée de centaines de chaînes ou d'autres sites feuilletées dans une seule expérience. (1 pe Cependant, les grandes quantités de données générées ca. Gbr min) de rendre l'identification visuelle et l'analyse de Ca ²⁺ locale événements impraticable. Ici, nous décrire et démontrer les procédures pour l'acquisition, la détection et l'analyse des IP locale ₃ médiée Ca ²⁺ signaux dans les cellules mammifères intactes chargés de Ca ²⁺ indicateurs utilisant à la fois grand champ épi-fluorescence (WF) et la réflexion interne totale fluorescence (FRBR) microscopie. En outre, nous décrivons un algorithme développé au sein de l'open-source environnement logiciel Python qui automatise l'identification et l'analyse de ces signaux locaux Ca ^2+. L'algorithme localise les sites de Ca ²⁺ de presse avec une résolution sous-pixel; permet d'avis utilisateur des données; et délivre séquences temporelles de signaux de rapport de fluorescence avec amplitude et données cinétiques dans un tableau Excel compatible.

Introduction

Les ions calcium (Ca2 ⁺⁾ régulent ubiquitaire un large éventail de processus biologiques, y compris l'expression des gènes, la sécrétion et des changements durables dans la plasticité synaptique ^1. Un moyen par lequel Ca ²⁺ peut agir de manière diversifiée est à travers les différentes configurations spatiales et temporelles de Ca ²⁺ signale une cellule peut générer. Par exemple, les élévations mondiaux dans cytosolique [Ca ^2+] déclenchement de la contraction dans le tissu musculaire lisse ² alors plus petit, élévations transitoires localisées (locales ^{Ca2 +)} microdomaines stimuler l'expression de gène essentiel pour l'apprentissage et la mémoire ^3.

Cytosolique libre [Ca ^2+] est maintenue à ~ 100 nM au repos, mais peut rapidement se élever à plusieurs micro-molaire suivante l'afflux de Ca2 ⁺ dans le cytosol par Ca ²⁺ canaux ioniques -permeable situés dans la membrane plasmique et par la libération de Ca ²⁺ intracellulaire de stores. Notre laboratoire se concentre sur le récepteur de l'inositol 1,4,5-triphosphate (IP ₃ R), qui forme un canal de libération ²⁺ Ca situé dans la membrane du réticulum endoplasmique (RE). Lors de la liaison à la fois de _IP3 et Ca2 ⁺ cytosolique à l'activation des sites du récepteur, le canal R IP ₃ se ouvre pour libérer Ca2 ⁺ séquestré dans la lumière du RE. La libération de Ca ²⁺ peut rester dans l'espace restreint à un petit groupe de IP ₃ Rs pour générer un microdomaine cytosolique locale de Ca2 ⁺ (Ca ²⁺ feuilletée ⁴⁾ ou, en fonction de la proximité des pôles voisins de IP ₃ Rs, peut propager dans une cellule en recrutant plusieurs sites feuilletées par un processus de Ca ²⁺ induite par Ca ²⁺ -release (CICR) ^5,6.

L'introduction d'indicateurs les colorants ^de petite molécule fluorescente Ca développé par Roger Tsien ^7, couplé avec la microscopie avancée Imaging techniques, a grandement facilité notre compréhension de Ca ²⁺ signalisation. Les progrès récents en caméras utilisées pour la microscopie permettent désormais pour l'imagerie transitoires locales Ca ²⁺ événements tels que bouffées avec une résolution spatiale et temporelle sans précédent. Actuellement disponibles caméras EMCCD permettent imagerie avec 128 x 128 pixels à 500 images> ^-1 sec (fps) et la nouvelle génération de semi-conducteur complémentaire à oxyde de métal (CMOS) caméras offrent une résolution de pixels, et la vitesse encore plus rapide au détriment de légèrement plus élevé des niveaux de bruit. En collaboration avec réflexion totale interne (FRBR) microscopie, il est maintenant possible d'une seule image Ca ²⁺ Les événements de canaux ^8,9. Cette approche permet l'imagerie de centaines de canaux / événements simultanément, tout en générant de grands ensembles de données (environ 1 Go par min) qui rendent le traitement manuel, l'identification visuelle et l'analyse impraticable et placer un fardeau sur le développement d'algorithmes automatisés.

<p class = "jove_content"> Ici, nous présentons des procédures et des protocoles pour l'imagerie locales Ca ²⁺ signaux dans les cellules de mammifères en utilisant intactes fluorescentes Ca ²⁺ indicateurs. Nous démontrons en outre un algorithme développé dans l'environnement Python open-source qui automatise l'identification et l'analyse de Ca ²⁺ événements locaux imagés à la fois par la FRBR et large champ épi-fluorescence conventionnelle (WF) microscopie. Bien que nous décrivons ces approches dans le contexte de la PI ₃ -generated signaux ^{Ca2 +,} ils sont facilement prête pour étudier les changements locaux dans cytosolique [Ca ^2+] issues d'une variété de Ca ²⁺ canaux ioniques -permeable situés soit dans la surface ou membrane d'organites intracellulaires ^10/08.

Protocol

Nous présentons des procédures détaillées pour l'imagerie locales Ca 2+ événements dans les cellules SH-SY5Y neuroblastome humain. Ces procédures peuvent être adaptées à l'image de Ca 2+ intracellulaire des signaux dans de nombreux types cellulaires 10/08. 1. Préparation des cellules Culture des cellules à imager selon les instructions figurant sur le site Internet de leur fournisseur. Quelques jours avant l'imager…

Representative Results

Figure 1A montre une image WF de repos Cal-520 fluorescence dans les cellules de neuroblastome SH-SY5Y humains également chargé avec 3 ci-IP. L'exposition de ces cellules à un flash 100 UV msec à la photo-presse i-IP 3 a suscité transitoires Ca2 + bouffées sur des sites discrets (relevées par les cercles blancs sur la figure 1A). traces de fluorescence mesurée à ces sites ont montré une phase de montée rapide en raison d'ouvertures de …

Discussion

Nous décrivons ici les protocoles pour l'imagerie locales Ca ²⁺ événements dans des cellules de mammifères cultivées en utilisant fluorescentes Ca ²⁺ indicateurs. En outre, nous décrivons un algorithme avec une interface utilisateur intuitive qui automatise l'identification et l'analyse des données acquises. La procédure décrite ici utilisent le Ca ²⁺ fluorescente indicateur Cal-520, mais beaucoup d'autres colorants Ca ²⁺ sensibles comme Fluo-3, Fluo-4…

Materials

Name	Company	Catalogue No.
Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells	ATCC	CRL-2266
Cal-520/AM	AAT Bioquest Inc.	21130
ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4.5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 145-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl)	SiChem	cag-iso-2-145-10
DMSO/20% pluronic F127	Invitrogen	P-3000MP
EGTA/AM	Invitrogen	E-1219
35 mm glass-bottom imaging dishes	MatTek	P35-1.5-14-C