Imaging locale Ca²⁺ Segnali in cellule di mammifero coltivate

Summary

Here we present techniques for imaging local IP₃-mediated Ca²⁺ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca²⁺ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Abstract

Ca citosolico ^{2 +} ioni regolano numerosi aspetti della attività cellulare in quasi tutti i tipi di cellule, il controllo dei processi più ampio respiro, come la trascrizione genica, eccitabilità elettrica e la proliferazione cellulare. La diversità e la specificità di Ca ²⁺ segnale deriva da meccanismi con cui Ca ²⁺ segnali vengono generati ad agire su diversi temporali e spaziali scale, che vanno da oscillazioni e onde a livello delle cellule che si verificano durante i periodi di minuti per locali transitorie Ca ²⁺ microdomini (Ca ²⁺⁾ sbuffi millisecondi duraturi. I recenti progressi nella elettroni moltiplicati CCD (EMCCD) telecamere ora consente l'imaging di locali Ca ²⁺ segnali con una risoluzione spaziale 128 x 128 pixel a velocità> 500 fotogrammi sec ^-1 (fps). Questo approccio è altamente parallelo e consente il monitoraggio simultaneo di centinaia di canali o siti sfoglia in un singolo esperimento. Tuttavia, la grande quantità di dati generati (ca. 1 pe Gbr min) rendono identificazione visiva e l'analisi di Ca ²⁺ locale eventi impraticabile. Qui si descrivono e dimostrare le procedure per l'acquisizione, la rilevazione e l'analisi di IP locale ₃ mediata Ca ²⁺ segnali nelle cellule dei mammiferi intatte cariche di Ca ²⁺ indicatori utilizzando sia a livello di campo epi-fluorescenza (WF) e la riflessione interna totale fluorescenza (TIRF) microscopia. Inoltre, descriviamo un algoritmo sviluppato all'interno del software dell'ambiente Python open-source che automatizza l'identificazione e l'analisi di questi locali Ca ²⁺ segnali. L'algoritmo localizza i siti di rilascio di Ca ²⁺ con una risoluzione sub-pixel; permette recensione dei dati; e uscite sequenze temporali di segnali rapporto di fluorescenza con ampiezza e dati cinetici in una tabella compatibile con Excel.

Introduction

Ioni calcio (Ca ²⁺⁾ regolano ubiquitariamente una vasta gamma di processi biologici, tra cui l'espressione genica, la secrezione e cambiamenti duraturi nella plasticità sinaptica ^1. Un modo attraverso il quale Ca ²⁺ può agire in modo così eterogeneo è attraverso i diversi modelli spaziali e temporali di Ca ²⁺ segnala una cellula in grado di generare. Ad esempio aumenti globali in citosolico [Ca ^2+] contrazione grilletto nel tessuto muscolare liscio ² mentre più piccola, aumenti transitori localizzati (locali Ca ²⁺ microdomini) stimolare l'espressione genica indispensabile per l'apprendimento e la memoria ^3.

Citosolico libero [Ca ^2+] viene mantenuta a ~ 100 nm a riposo, ma può rapidamente salire a diversi micro-molare dopo l'afflusso di Ca ²⁺ nel citoplasma attraverso Ca ²⁺ canali ionici -permeable situati nella membrana plasmatica e la liberazione di Ca ²⁺ da s intracellulariTores. Il nostro laboratorio si concentra sulla inositolo 1,4,5-trifosfato recettore (IP ₃ R), che forma un canale di rilascio Ca ²⁺ trova nella membrana del reticolo endoplasmatico (ER). In seguito al legame di entrambi IP ₃ e Ca ²⁺ al citosolico attivando siti del recettore, il canale IP ₃ R apre per liberare Ca ²⁺ sequestrato nel lume ER. Il rilascio di Ca ²⁺ può rimanere spazialmente limitata ad un piccolo gruppo di IP ₃ Rs per generare un microdomini citosolico locale del Ca ²⁺ (Ca ²⁺ sfoglia ⁴⁾ oppure, a seconda della prossimità del cluster vicini di IP ₃ Rs, può propagare una cella con l'assunzione di più siti sfoglia attraverso un processo di Ca ²⁺ indotta Ca ²⁺ -release (CICR) ^5,6.

L'introduzione di piccole molecole fluorescenti Ca ²⁺ indicatore coloranti sviluppato da Roger Tsien ^7, insieme con avanzate di microscopia Imagitecniche ng, ha notevolmente facilitato la nostra comprensione di Ca ²⁺ segnalazione. I recenti progressi nella telecamere utilizzate per microscopia permettono ora per l'imaging transitori locali Ca ²⁺ eventi come sbuffi con risoluzione spaziale e temporale senza precedenti. Attualmente disponibili telecamere EMCCD consentono di imaging con 128 x 128 pixel a> 500 fotogrammi sec ^-1 (fps) e la nuova generazione di complementari a semiconduttore metallo-ossido (CMOS) telecamere forniscono pixel di risoluzione più alta, e la velocità ancora più veloce a scapito della leggermente superiore livelli di rumore. In combinazione con la riflessione interna (TIRF) microscopia totale è ora possibile per singola immagine Ca ²⁺ eventi di canale ^8,9. Questo approccio permette di immagini di centinaia di canali / eventi contemporaneamente, mentre la generazione di grandi quantità di dati (circa 1Gb al minuto) che rendono l'elaborazione manuale, identificazione visiva e l'analisi impraticabile e pongono un onere per lo sviluppo di algoritmi automatizzati.

<p class = "jove_content"> Qui, vi presentiamo le procedure e protocolli per l'imaging locali Ca ²⁺ segnali nelle cellule di mammifero intatte utilizzando fluorescenti Ca ²⁺ indicatori. Dimostriamo inoltre un algoritmo sviluppato in ambiente Python open-source che automatizza l'identificazione e l'analisi dei locali Ca ²⁺ eventi immaginati sia TIRF e convenzionale ampio campo epi-fluorescenza (WF) microscopia. Anche se descriviamo questi approcci nel contesto di IP ₃ -Generata Ca ²⁺ segnali, essi sono facilmente suscettibili di studiare i cambiamenti locali in citosolico [Ca ^2+] provenienti da una varietà di Ca ²⁺ canali ionici -permeable situate sia in superficie membrana o organelli intracellulari ^8-10.

Protocol

Vi presentiamo le procedure dettagliate per l'imaging locali Ca 2+ eventi nelle cellule SH-SY5Y neuroblastoma umano. Tali procedure possono essere adattati a immagine intracellulare Ca 2+ segnali in molti tipi cellulari 8-10. 1. Preparazione di cellule Cultura le cellule per essere ripreso secondo le istruzioni elencate sul sito web del fornitore. Pochi giorni prima di imaging, le cellule coltivate raccolto in un pallone di coltura di…

Representative Results

La figura 1A mostra un'immagine WF di riposo Cal-520 di fluorescenza in cellule di neuroblastoma SH-SY5Y umani anche carichi di ci-IP 3. L'esposizione di queste cellule di un lampo di 100 msec UV per foto-release i-IP 3 suscitato transitori Ca 2+ sbuffi in siti discreti (rilevate dai cerchi bianchi in Figura 1A). Tracce di fluorescenza misurati a questi siti hanno mostrato una rapida fase di lievitazione causa aperture transitori di IP 3</su…

Discussion

Descriviamo qui di protocolli per l'imaging locali Ca ²⁺ eventi in cellule di mammifero utilizzando fluorescenti Ca ²⁺ indicatori. Inoltre, descriviamo un algoritmo con un'interfaccia utente intuitiva che consente di automatizzare l'identificazione e l'analisi dei dati acquisiti. La procedura descritta qui utilizzare la fluorescenza Ca ²⁺ indicatore Cal-520, ma molti altri Ca ²⁺ coloranti sensibili come Fluo-3, Fluo-4, Fluo-8 e Oregon verde BAPTA-1 eseguire suf…

Materials

Name	Company	Catalogue No.
Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells	ATCC	CRL-2266
Cal-520/AM	AAT Bioquest Inc.	21130
ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4.5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 145-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl)	SiChem	cag-iso-2-145-10
DMSO/20% pluronic F127	Invitrogen	P-3000MP
EGTA/AM	Invitrogen	E-1219
35 mm glass-bottom imaging dishes	MatTek	P35-1.5-14-C