Livraison de<em> In Vivo</em> Aiguë intermittente hypoxie néonatale dans Rongeurs au Premier-ventriculaire Zone dérivés de cultures de cellules progénitrices neurales

Summary

Cet article décrit la méthodologie de l'administration de courtes périodes de hypoxie intermittente à jour 1-8 rat ou de souris chiots postnatales. Cette approche suscite effectivement un niveau de tissu robuste »d'amorçage effet" sur les cellules progénitrices neurales cultivées qui sont récoltées dans les 30 min d'exposition à l'hypoxie.

Abstract

Extended culture of neural stem/progenitor cells facilitates in vitro analyses to understand their biology while enabling expansion of cell populations to adequate numbers prior to transplantation. Identifying approaches to refine this process, to augment the production of all CNS cell types (i.e., neurons), and to possibly contribute to therapeutic cell therapy protocols is a high research priority. This report describes an easily applied in vivo “pre-conditioning” stimulus which can be delivered to awake, non-anesthetized animals. Thus, it is a non-invasive and non-stressful procedure. Specifically described are the procedures for exposing mouse or rat pups (aged postnatal day 1-8) to a brief (40-80 min) period of intermittent hypoxia (AIH). The procedures included in this video protocol include calibration of the whole-body plethysmography chamber in which pups are placed during AIH and the technical details of AIH exposure. The efficacy of this approach to elicit tissue-level changes in the awake animal is demonstrated through the enhancement of subsequent in vitro expansion and neuronal differentiation in cells harvested from the subventricular zone (SVZ). These results support the notion that tissue level changes across multiple systems could be observed following AIH, and support the continued optimization and establishment of AIH as a priming or conditioning modality for therapeutic cell populations.

Introduction

Le but de ce procédé est de fournir de manière efficace et reproductible des matchs intermittente systémique oxygène ambiant réduit de rongeurs nouveau-nés. La justification de l'utilisation hypoxie intermittente (IH) pour manipuler la biologie des cellules souches in vitro provient d'expériences de culture cellulaire dans laquelle la teneur _en O 2 du milieu de croissance est modifiée. Plus précisément, par rapport à des conditions «standard» de 20% de O _2, de la culture prolongée de souches / progénitrices des cellules de populations de cellules dans 3% d'O _{2 résultats} à une prolifération accrue, une diminution de l'apoptose neuronale et un rendement accru ^{de 1,2.}

Ce groupe a une grande expérience de l'administration de IH systémique, et a mené des études approfondies sur le rôle de l'IH dans la plasticité respiratoire ^3-7. Ce travail, et la découverte récente que IH chronique augmente la neurogénèse chez le rongeur CNS ^8-10, constitue la base pour l'exploration de aiguë in vivohypoxie comme un stimulus de préconditionnement (ie., avant la récolte de tissu) sur la culture subséquente de cellules souches / progénitrices neurales (PNJ) ^11. Remarquablement, lorsque les souriceaux ont été exposés à une brève période (<1 h) de l'hypoxie aiguë intermittente (AIH), les cellules qui ont été récoltées dans la zone sous-ventriculaire (SVZ) avaient augmenté de façon significative la capacité d'expansion que neurosphères ou monocouches de cellules adhérentes. Le protocole AIH était également associée à une expression accrue d'un "destinée neuronale" facteur de transcription (Pax6).

En conséquence, in vivo protocoles HAI peuvent fournir un moyen de «prime» PNJ avant la culture. Par exemple, les demandes de cette approche peuvent inclure l'expansion des populations de cellules avant la transplantation dans le système nerveux central blessé, ou augmentant simplement la différenciation neuronale de cellules en culture avant des expériences in vitro. En outre, parce que cela est une administration systémique, touteorgane, le tissu ou la cellule est un candidat pour étude similaire. Par conséquent, le protocole écrit est potentiellement applicable à une large gamme d'études sur la manipulation de l'oxygène intermittente chez les petits mammifères.

Il ya certains avantages à cette approche. Dans d'autres travaux publiés, les nouveau-nés ont été traités comme une litière avec le barrage en chambre hypobare, qui permet le dosage chronique, moins de manipulation avant le traitement, et maintenu le contact maternelle pendant le traitement ^9. L'approche actuelle contourne traitements répétés à une femelle reproductrice, ou l'utilisation d'un barrage différent pour chaque expérience. Ce protocole permet également l'étude des nouveau-nés de la litière appariés et appariés pour l'âge précis. Les données représentatives démontrent un autre atout majeur de ce protocole, à savoir la rapidité avec laquelle AIH, tel que livré, provoque une réponse biologique puissante et cohérente dans neuronal la biologie des cellules souches. Cela établit un précédent pour ce protocole de susciter biologi tissulaire et cellulaire niveauCAL changements qui modifient la biologie cellulaire.

Le présent rapport décrit les procédures détaillées utilisées pour exposer rongeurs chiots à IAC ainsi que l'analyse de la population de cellules SVZ grandi comme neurosphères.

Protocol

NOTE: Toutes les procédures d'animaux dans ce protocole sont menées avec l'approbation de l'Université de Floride institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité (IACUC) et sont en conformité avec le «Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire». 1. expérimentale de base mis en place avant l'administration intermittente hypoxie Exposer chiots 12 aux différents mélanges de gaz en utilisant un corps ent…

Representative Results

Les premières expériences, basées sur des données historiques, ont été effectuées en utilisant des longueurs de cycle 1 min. Sur la base des calibrations ultérieures effectuées à l'étape 2 ci-dessus, on a déterminé que le niveau d'O 2 dans la chambre était de 13% à 1 min post-rinçage et l'hypoxie, qu'il a fallu un temps similaire pour revenir à la ligne de base de 21%. Cependant, un cycle de 2 min est suffisante pour atteindre à la fois 10% d'oxygène et un retour à 21% …

Discussion

This work reports the development of a protocol to expose neonatal rodents to AIH. The parameters described here effectively alter in situ neural stem cell biology, which is observable over several rounds of cell passage. Specifically, AIH increases the number of non-adherent neurospheres, the expansion of cells within each neurosphere (refected by sphere diameter), the expansion of adherent NPC populations, and the presence of neuroblasts in both non-adherent and adherent populations. It should be emph…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Mouse plethysmography chambers	Buxco	PLY4211
Flow meter	Porter	F150
Bias flow unit	AFPS
Baseline Gas Mix	Airgas	AIZ300	Compressed Air
Hypoxic Gas Mix	Airgas	X03NI72C2000189	10% Oxygen, balance nitrogen
Oxygen Meter	Teledyne	AX-300