Lieferung von<em> In-vivo-</em> Akuter intermittierender Hypoxie in Neonatal Nagetiere in den Prime Subventrikularzone abgeleiteten neuronalen Vorläuferzellkulturen
Summary
Dieser Artikel beschreibt die Methodik für die Verwaltung von kurzen Perioden intermittierender Hypoxie zu postnatalen Tag 1-8 Maus oder Ratte Welpen. Dieser Ansatz effektiv löst eine robuste Gewebeniveau "Priming-Effekt" an kultivierten neuralen Vorläuferzellen, die innerhalb von 30 Minuten von Hypoxie Exposition geerntet werden.
Abstract
Extended culture of neural stem/progenitor cells facilitates in vitro analyses to understand their biology while enabling expansion of cell populations to adequate numbers prior to transplantation. Identifying approaches to refine this process, to augment the production of all CNS cell types (i.e., neurons), and to possibly contribute to therapeutic cell therapy protocols is a high research priority. This report describes an easily applied in vivo “pre-conditioning” stimulus which can be delivered to awake, non-anesthetized animals. Thus, it is a non-invasive and non-stressful procedure. Specifically described are the procedures for exposing mouse or rat pups (aged postnatal day 1-8) to a brief (40-80 min) period of intermittent hypoxia (AIH). The procedures included in this video protocol include calibration of the whole-body plethysmography chamber in which pups are placed during AIH and the technical details of AIH exposure. The efficacy of this approach to elicit tissue-level changes in the awake animal is demonstrated through the enhancement of subsequent in vitro expansion and neuronal differentiation in cells harvested from the subventricular zone (SVZ). These results support the notion that tissue level changes across multiple systems could be observed following AIH, and support the continued optimization and establishment of AIH as a priming or conditioning modality for therapeutic cell populations.
Introduction
Das Ziel dieser Methode ist es, reproduzierbar und effizient zu liefern intermittierende Anfälle von systemischen abgesenkt Umgebungssauerstoff zu neonatalen Nagetiere. Der Grund für die Verwendung intermittierender Hypoxie (IH) Stammzellen biology manipulieren stammt von in vitro Zellkulturexperimente, in denen O 2 -Gehalt des Wachstumsmediums verändert wird. Insbesondere im Vergleich zu "normalen" Bedingungen von 20% O 2, verlängerte Kultur von Stammzellen / Vorläuferzellpopulationen Zellen in 3% O 2 führt zu einer erhöhten Proliferation, Apoptose verringert und erhöhte neuronale Ausbeute 1,2.
Diese Gruppe hat umfangreiche Erfahrungen mit der Verabreichung von systemischen IH und hat umfangreiche Studien über die Rolle der IH in Atem Plastizität 3-7 durchgeführt. Diese Arbeit und die jüngste Entdeckung, dass chronische IH erhöhte Neurogenese im Nagetier CNS 8-10, bildet die Grundlage für die Erforschung der akuten in vivoHypoxie als Vorkonditionierung Stimulus (dh., vor der Gewebeernte) auf die anschließende Kultur von neuronalen Stammzellen / Vorläuferzellen (NPC) 11. Bemerkenswert ist, wenn die Maus Jungtiere wurden auf eine kurze (<1 Stunde) Zeit der akute intermittierende Hypoxie (AIH) ausgesetzt sind, Zellen, die aus der Subventrikularzone (SVZ) geerntet wurden, hatten signifikant erhöhte Kapazität für die Expansion als Neurosphären oder anhaftenden Monolayer-Zellen. AIH Protokoll wurde auch mit einer erhöhten Expression eines "neuronalen Schicksals" Transkriptionsfaktor (Pax6) zugeordnet ist.
Dementsprechend wird in vivo AIH Protokolle kann ein Mittel zur "prime" NPCs vor der Kultur zu schaffen. Beispielsweise könnten Anwendungen für diesen Ansatz sind die Erweiterung Zellpopulationen vor der Transplantation in das verletzte Zentralnervensystems, oder einfach die Erhöhung der neuronalen Differenzierung von kultivierten Zellen vor der in vitro-Experimente. Ferner kann, da dies eine systemische Verabreichung, jedeOrgan, Gewebe oder Zellen, ist ein Kandidat für ähnliche Studie. Daher ist das Protokoll geschrieben potenziell für eine breite Palette von Studien über intermittierende Sauerstoff Manipulation in kleinen Säugetieren.
Es gibt bestimmte Vorteile für diese Vorgehensweise. In anderen veröffentlichten Arbeiten wurden Neugeborenen als ein Wurf mit der Staumauer in Unterdruckkammern, die für die Langzeitanwendung vor der Behandlung ermöglicht, weniger Handling behandelt und gepflegt mütterlichen Kontakt während der Behandlung 9. Der derzeitige Ansatz umgeht wiederholten Behandlungen zu einer Zuchthündin, oder die Verwendung einer anderen Damm für jedes Experiment. Dieses Protokoll erlaubt auch Studium der präzisen Wurf abgestimmt und altersangepassten Neugeborenen. Repräsentative Daten zeigen eine weitere wesentliche Stärke dieses Protokolls, nämlich die Schnelligkeit, mit der AIH, wie geliefert, löst eine leistungsstarke und einheitliche biologische Reaktion in neuronalen Stammzellbiologie. Dies schafft einen Präzedenzfall für dieses Protokoll, um Gewebe- und Zellebene biologi entlockencal Änderungen, die Zellbiologie zu ändern.
Dieser Bericht wird die detaillierten Verfahren zur Belichtung von Nagetier Welpen zur AIH sowie die Populationsanalyse der SVZ-Zellen als Neurosphären verwendet gewachsen zu skizzieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
This work reports the development of a protocol to expose neonatal rodents to AIH. The parameters described here effectively alter in situ neural stem cell biology, which is observable over several rounds of cell passage. Specifically, AIH increases the number of non-adherent neurospheres, the expansion of cells within each neurosphere (refected by sphere diameter), the expansion of adherent NPC populations, and the presence of neuroblasts in both non-adherent and adherent populations. It should be emph…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding sources responsible for this work: 5K12HD055929 (HHR), 5R01NS080180-02 (DDF).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Mouse plethysmography chambers | Buxco | PLY4211 | |
| Flow meter | Porter | F150 | |
| Bias flow unit | AFPS | ||
| Baseline Gas Mix | Airgas | AIZ300 | Compressed Air |
| Hypoxic Gas Mix | Airgas | X03NI72C2000189 | 10% Oxygen, balance nitrogen |
| Oxygen Meter | Teledyne | AX-300 |
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