Доставка<em> В Vivo</em> Острая перемежающейся Гипоксия у новорожденных Грызуны премьер субвентрикулярной зоне, полученных из нейронных клеток-предшественников культур
Summary
Эта статья описывает методику введения короткие периоды прерывистого гипоксии в постнатальном день 1-8 мыши или крысят. Этот подход фактически вызывает устойчивый уровень ткань "грунтовки эффект" на культивируемых нейронных клеток-предшественников, которые собирают в течение 30 мин воздействия гипоксии.
Abstract
Extended culture of neural stem/progenitor cells facilitates in vitro analyses to understand their biology while enabling expansion of cell populations to adequate numbers prior to transplantation. Identifying approaches to refine this process, to augment the production of all CNS cell types (i.e., neurons), and to possibly contribute to therapeutic cell therapy protocols is a high research priority. This report describes an easily applied in vivo “pre-conditioning” stimulus which can be delivered to awake, non-anesthetized animals. Thus, it is a non-invasive and non-stressful procedure. Specifically described are the procedures for exposing mouse or rat pups (aged postnatal day 1-8) to a brief (40-80 min) period of intermittent hypoxia (AIH). The procedures included in this video protocol include calibration of the whole-body plethysmography chamber in which pups are placed during AIH and the technical details of AIH exposure. The efficacy of this approach to elicit tissue-level changes in the awake animal is demonstrated through the enhancement of subsequent in vitro expansion and neuronal differentiation in cells harvested from the subventricular zone (SVZ). These results support the notion that tissue level changes across multiple systems could be observed following AIH, and support the continued optimization and establishment of AIH as a priming or conditioning modality for therapeutic cell populations.
Introduction
Цель этого метода заключается в воспроизводимо и эффективно доставить прерывистый приступы системного снижена кислородом воздуха для новорожденных грызунов. Обоснованием для использования прерывистый гипоксии (IH), чтобы манипулировать биологии стволовых клеток происходит от в пробирке экспериментов на клеточных культурах, в которых O 2 содержание питательных сред меняется. В частности, по сравнению с "стандартных" условиях 20% O 2, расширенный культуры клеточных популяций стволовых клеток / клеток-предшественников в 3% O 2 приводит к усилению пролиферации, апоптоза снизился и увеличилась нейронов выход 1,2.
Эта группа имеет значительный опыт работы с администрацией системного IH, и провел обширные исследования о роли IH в дыхательных пластичности 3-7. Эта работа, а также недавнее открытие, что хронический IH увеличился нейрогенез в грызуна ЦНС 8-10, формирует основу для исследования в естественных условиях остройгипоксия как предварительной подготовки стимула (т.е.., до сбора урожая ткани) на последующее культуры нервных стволовых клеток / клеток-предшественников (НПС) 11. Примечательно, что, когда щенков мыши подвергались краткого (<1 ч) периода острой перемежающейся гипоксии (АИГ), клетки, которые были собраны из субвентрикулярной зоне (SVZ) значительно увеличенную емкость для расширения как нейросферах или адгезивных клеток монослоя. Протокол АИГ был также связан с повышенной экспрессией в "нейронов судьба" фактора транскрипции (Pax6).
Соответственно, в естественных условиях протоколы АИГ может обеспечить средства для "премьер" НПС до культуры. Например, приложения для данного подхода может включать расширение популяции клеток перед трансплантацией в поврежденный центральной нервной системы, или просто повышение нейрональной дифференцировки культивированных клеток до экспериментов в пробирке. Кроме того, потому что это системный доставку любойорган, ткань или клетки является кандидатом на аналогичном исследовании. Таким образом, протокол, как написано потенциально применимы к широкому кругу исследований по прерывистой манипуляции кислорода в мелких млекопитающих.
Есть определенные преимущества такого подхода. В другой опубликованной работе, новорожденные были рассматриваться как помет с плотины в барокамер, что позволяет при хронических дозирования, меньше управляемость до лечения, и поддерживается материнской контакт во время лечения 9. Нынешний подход обходит повторные процедуры для разведения женщина, или использование другого плотины для каждого эксперимента. Этот протокол также позволяет исследование точных мусора соответствием и соответствующего возраста новорожденных. Представительства данные показывают еще один ключевой силу этого протокола, а именно скорость, с которой АИГ, как поставлено, вызывает мощной и последовательной биологическую реакцию в нервной биологии стволовых клеток. Это создает прецедент для этого протокола вызывать ткани, так и сотовой уровня биологически актические изменения, которые изменяют клеточной биологии.
Этот отчет будет наметить подробные процедуры, используемые для разоблачения грызунов щенков в АИГ, а также анализ популяции клеток, выращенных СВЗ в нейросфер.
Protocol
Representative Results
Discussion
This work reports the development of a protocol to expose neonatal rodents to AIH. The parameters described here effectively alter in situ neural stem cell biology, which is observable over several rounds of cell passage. Specifically, AIH increases the number of non-adherent neurospheres, the expansion of cells within each neurosphere (refected by sphere diameter), the expansion of adherent NPC populations, and the presence of neuroblasts in both non-adherent and adherent populations. It should be emph…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding sources responsible for this work: 5K12HD055929 (HHR), 5R01NS080180-02 (DDF).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Mouse plethysmography chambers | Buxco | PLY4211 | |
| Flow meter | Porter | F150 | |
| Bias flow unit | AFPS | ||
| Baseline Gas Mix | Airgas | AIZ300 | Compressed Air |
| Hypoxic Gas Mix | Airgas | X03NI72C2000189 | 10% Oxygen, balance nitrogen |
| Oxygen Meter | Teledyne | AX-300 |
References
- Studer, L., et al. Enhanced proliferation, survival, and dopaminergic differentiation of CNS precursors in lowered oxygen. J Neurosci. 20 (19), 7377-7383 (2000).
- Chen, H. L., et al. Oxygen tension regulates survival and fate of mouse central nervous system precursors at multiple levels. Stem Cells. 25 (9), 2291-2301 (2007).
- Ling, L., et al. Chronic intermittent hypoxia elicits serotonin-dependent plasticity in the central neural control of breathing. J Neurosci. 21 (14), 5381-5388 (2001).
- Mitchell, G. S., et al. Invited review: Intermittent hypoxia and respiratory plasticity. J Appl Physiol. 90 (6), 2466-2475 (2001).
- Fuller, D. D., Zabka, A. G., Baker, T. L., Mitchell, G. S. Phrenic long-term facilitation requires 5-HT receptor activation during but not following episodic hypoxia. J Appl Physiol. 90 (5), 2001-2006 (2001).
- Fuller, D. D., Johnson, S. M., Olson, E. B., Mitchell, G. S. Synaptic pathways to phrenic motoneurons are enhanced by chronic intermittent hypoxia after cervical spinal cord injury. J Neurosci. 23 (7), 2993-3000 (2003).
- Baker-Herman, T. L., et al. BDNF is necessary and sufficient for spinal respiratory plasticity following intermittent hypoxia. Nat Neurosci. 7 (1), 48-55 (2004).
- Zhu, L. L., et al. Neurogenesis in the adult rat brain after intermittent hypoxia. Brain Res. 1055, 1-6 (2005).
- Zhang, J. X., Chen, X. Q., Du, J. Z., Chen, Q. M., Zhu, C. Y. Neonatal exposure to intermittent hypoxia enhances mice performance in water maze and 8-arm radial maze tasks. Journal of neurobiology. 65 (1), 72-84 (2005).
- Zhu, L. L., Wu, L. Y., Yew, D. T., Fan, M. Effects of hypoxia on the proliferation and differentiation of NSCs. Mol Neurobiol. 31 (1-3), 231-242 (2005).
- Ross, H. H., et al. In vivo intermittent hypoxia elicits enhanced expansion and neuronal differentiation in cultured neural progenitors. Exp Neurol. 235 (1), 238-245 (2012).
- Fuller, D. D., et al. Induced recovery of hypoxic phrenic responses in adult rats exposed to hyperoxia for the first month of life. J Physiol. 536 (Pt 3), 917-926 (2001).
- Fuller, D. D., Fregosi, R. F. Fatiguing contractions of tongue protrudor and retractor muscles: influence of systemic hypoxia. J Appl Physiol. 88 (6), 2123-2130 (2000).
- Baker, T. L., Fuller, D. D., Zabka, A. G., Mitchell, G. S. Respiratory plasticity: differential actions of continuous and episodic hypoxia and hypercapnia. Respir Physiol. 129 (1-2), 25-35 (2001).
- Marshall, G. P., et al. Production of neurospheres from CNS tissue. Methods Mol Biol. 438, 135-150 (2008).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. (45), (2010).
