Entrega de<em> In Vivo</em> Aguda intermitente hipóxia em Neonatal Roedores ao primeiro-subventricular Zona derivados de culturas de células progenitoras neurais

Summary

Este artigo descreve a metodologia para a administração de curtos períodos de hipóxia intermitente para pós-natal 1-8 dia ratinho ou um rato filhotes. Esta abordagem suscita efectivamente um nível do tecido robusto "efeito priming" sobre as células progenitoras neurais em cultura que são colhidas no prazo de 30 min de exposição hipóxia.

Abstract

Extended culture of neural stem/progenitor cells facilitates in vitro analyses to understand their biology while enabling expansion of cell populations to adequate numbers prior to transplantation. Identifying approaches to refine this process, to augment the production of all CNS cell types (i.e., neurons), and to possibly contribute to therapeutic cell therapy protocols is a high research priority. This report describes an easily applied in vivo “pre-conditioning” stimulus which can be delivered to awake, non-anesthetized animals. Thus, it is a non-invasive and non-stressful procedure. Specifically described are the procedures for exposing mouse or rat pups (aged postnatal day 1-8) to a brief (40-80 min) period of intermittent hypoxia (AIH). The procedures included in this video protocol include calibration of the whole-body plethysmography chamber in which pups are placed during AIH and the technical details of AIH exposure. The efficacy of this approach to elicit tissue-level changes in the awake animal is demonstrated through the enhancement of subsequent in vitro expansion and neuronal differentiation in cells harvested from the subventricular zone (SVZ). These results support the notion that tissue level changes across multiple systems could be observed following AIH, and support the continued optimization and establishment of AIH as a priming or conditioning modality for therapeutic cell populations.

Introduction

O objetivo deste método é entregar reprodutível e eficaz ataques intermitentes de oxigênio sistêmico ambiente reduzido para roedores neonatais. A justificativa para o uso de hipóxia intermitente (IH) para manipular a biologia de células-tronco origina de em experimentos de cultura de células in vitro em que _O 2 conteúdo do meio de crescimento é alterada. Especificamente, quando comparadas com as condições "standard" de _20% de O2, cultura prolongada de células estaminais / progenitoras de células em populações de células _3% de O2 resulta num aumento da proliferação, diminuição e aumento da apoptose neuronal ^1,2 rendimento.

Este grupo tem uma experiência significativa com a administração de IH sistêmica, e já realizou extensos estudos sobre o papel do IH na plasticidade respiratória ^3-7. Este trabalho, ea recente descoberta de que IH crônica aumentou a neurogênese no roedor CNS ^10/08, constitui a base para a exploração do aguda in vivohipóxia como um estímulo pré-condicionamento (ie., antes da colheita de tecidos) sobre a cultura subsequente de células estaminais / progenitoras neurais (NPCs) ^11. Notavelmente, quando as crias de rato foram expostos a uma breve (<1 hora) período de hipoxia aguda intermitente (AIH), as células que foram colhidas a partir da zona subventricular (SVZ) tinha aumentado significativamente a capacidade de expansão como neuroesferas ou células em monocamadas aderentes. O protocolo AIH também foi associado com o aumento da expressão de um fator de transcrição "destino neuronal" (Pax6).

Deste modo, in vivo protocolos AIH pode proporcionar um meio para "Prime" NPCs antes da cultura. Por exemplo, os pedidos de esta abordagem poderia incluir a expansão das populações de células antes do transplante para o sistema nervoso central lesionado, ou simplesmente aumentando a diferenciação neuronal de células cultivadas antes de experiências in vitro. Além disso, porque esta é uma entrega sistémica, qualquerórgão, tecido ou célula é um candidato para o estudo semelhante. Portanto, o protocolo é como escrito potencialmente aplicáveis ​​a uma ampla gama de estudos sobre a manipulação de oxigénio intermitente em pequenos mamíferos.

Existem algumas vantagens para esta abordagem. Em outro trabalho publicado, recém-nascidos foram tratados como uma ninhada com a barragem em câmaras hipobáricas, que permite a administração crónica, menos manuseio antes do tratamento, e manteve contato materno durante o tratamento ^9. A abordagem actual ultrapassa tratamentos repetidos para uma fêmea de reprodução, ou o uso de uma barragem diferente para cada experimento. Este protocolo também permite o estudo de recém-nascidos pareados por ninhada e da mesma idade precisos. Os dados representativos demonstrar outra força fundamental deste protocolo, ou seja, a rapidez com que AIH, como entregue, provoca uma resposta biológica poderosa e consistente em biologia de células-tronco neurais. Isto estabelece um precedente para esse protocolo para provocar biologi Tecido e-nível celularcal mudanças que alteram a biologia celular.

Este relatório irá delinear os procedimentos detalhados utilizados para expor os filhotes de roedores a AIH, bem como a análise da população de células SVZ cultivadas como neurospheres.

Protocol

NOTA: Todos os procedimentos com animais neste protocolo são realizadas com a aprovação da University of Florida Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC) e estão em conformidade com o "Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório '. 1. Básica Experimental Set up antes da administração intermitente hipóxia Expor filhotes 12 a diferentes misturas de gás usando uma de corpo inteiro câmaras rato pletismógrafo em muito da mesma forma que…

Representative Results

Os experimentos iniciais, com base em dados históricos, foram conduzidos utilizando comprimentos de ciclo 1 min. Com base nos calibrações subsequentes realizados no Passo 2 acima, determinou-se que o nível de O2 na câmara era de 13% em 1 min de lavagem pós-hipoxia e, que teve um tempo semelhante para voltar à linha de base de 21%. No entanto, um ciclo de 2 minutos foi suficiente tanto para alcançar 10% de oxigénio e um retorno a 21% durante o ciclo de "linha de base". Subsequentemente, os c…

Discussion

This work reports the development of a protocol to expose neonatal rodents to AIH. The parameters described here effectively alter in situ neural stem cell biology, which is observable over several rounds of cell passage. Specifically, AIH increases the number of non-adherent neurospheres, the expansion of cells within each neurosphere (refected by sphere diameter), the expansion of adherent NPC populations, and the presence of neuroblasts in both non-adherent and adherent populations. It should be emph…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Mouse plethysmography chambers	Buxco	PLY4211
Flow meter	Porter	F150
Bias flow unit	AFPS
Baseline Gas Mix	Airgas	AIZ300	Compressed Air
Hypoxic Gas Mix	Airgas	X03NI72C2000189	10% Oxygen, balance nitrogen
Oxygen Meter	Teledyne	AX-300