Leverans av<em> In Vivo</em> Akut intermittent hypoxi i neonatal Gnagare Prime subventrikulära zonen-härledda neurala stamceller kulturer

Summary

I den här artikeln beskrivs metoden för att administrera korta perioder av intermittent hypoxi till postnatal dag 1-8 mus eller råttungar. Detta tillvägagångssätt effektivt framkallar en robust vävnadsnivå "priming effekt" på odlade neurala stamceller som skördas inom 30 min av hypoxi exponering.

Abstract

Extended culture of neural stem/progenitor cells facilitates in vitro analyses to understand their biology while enabling expansion of cell populations to adequate numbers prior to transplantation. Identifying approaches to refine this process, to augment the production of all CNS cell types (i.e., neurons), and to possibly contribute to therapeutic cell therapy protocols is a high research priority. This report describes an easily applied in vivo “pre-conditioning” stimulus which can be delivered to awake, non-anesthetized animals. Thus, it is a non-invasive and non-stressful procedure. Specifically described are the procedures for exposing mouse or rat pups (aged postnatal day 1-8) to a brief (40-80 min) period of intermittent hypoxia (AIH). The procedures included in this video protocol include calibration of the whole-body plethysmography chamber in which pups are placed during AIH and the technical details of AIH exposure. The efficacy of this approach to elicit tissue-level changes in the awake animal is demonstrated through the enhancement of subsequent in vitro expansion and neuronal differentiation in cells harvested from the subventricular zone (SVZ). These results support the notion that tissue level changes across multiple systems could be observed following AIH, and support the continued optimization and establishment of AIH as a priming or conditioning modality for therapeutic cell populations.

Introduction

Målet med denna metod är att reproducerbart och effektivt leverera intermittent anfall av systemisk sänkt omgivnings syre till nyfödda gnagare. Den logiska grunden för att använda intermittent hypoxi (IH) att manipulera stamcellsbiologi kommer från i cellodlings vitro experiment där _O2 halt av odlingsmediet ändras. Speciellt jämfört med "vanliga" villkoren för 20% O _2, förlängd kultur av stam / progenitorceller cellpopulationer celler i 3% O ₂ resulterar i ökad spridning, minskad apoptos och ökad neuronal avkastning ^1,2.

Denna grupp har betydande erfarenhet av administration av system IH, och har genomfört omfattande studier om vilken roll IH i andnings plasticitet ^3-7. Detta arbete, och den senaste upptäckten att kronisk IH ökad neurogenes i gnagare CNS ^10/08, utgör grunden för utforskning av akut in vivohypoxi som konditionerings stimulus (dvs. före vävnads skörd) på den efterföljande kultur neurala stam / progenitorceller (NPC) ^11. Anmärkningsvärt, när musen ungar utsattes för en kort (<1 timme) period av akut intermittent hypoxi (AIH), celler som skördades från subventrikulära zonen (SVZ) hade signifikant ökad kapacitet för expansion som neurospheres eller vidhäftande monoskiktceller. Den AIH-protokollet var också förenad med ökad expression av en "neuronal öde" transkriptionsfaktor (Pax6).

Följaktligen in vivo AIH protokoll kan tillhandahålla ett medel för att "prime" NPC före odling. Till exempel kan applikationer för detta tillvägagångssätt inkluderar expanderande cellpopulationer före transplantation in i skadade centrala nervsystemet, eller att helt enkelt öka neuronal differentiering av odlade celler före försök in vitro. Vidare, eftersom detta är en systemisk tillförsel, någonorgan, vävnad eller cell är en kandidat för liknande studie. Därför är det protokoll som skrivet potentiellt tillämplig på ett brett spektrum av studier på intermittent syre manipulation i små däggdjur.

Det finns vissa fördelar med detta tillvägagångssätt. I andra publicerade arbeten, var nyfödda behandlas som en kull med dammen i hypobaric kammare, som gör det möjligt för kronisk dosering, mindre hantering före behandlingen, och underhållas moderns kontakt under behandlingen ^9. Den nuvarande metoden kringgår upprepade behandlingar till en avelshona, eller användning av en annan damm för varje experiment. Detta protokoll kan också studera exakta kull-matchade och åldersmatchade nyfödda. Representativa data visar en annan viktig styrka detta protokoll, nämligen den snabbhet med vilken AIH, som levereras, framkallar en kraftfull och konsekvent biologiskt svar i neurala stamcellsbiologi. Det skapar ett prejudikat för detta protokoll för att framkalla vävnads- och cellnivå biological förändringar som förändrar cellbiologi.

Denna rapport kommer att beskriva de detaljerade förfaranden som används för att exponera gnagare valpar till AIH samt populationsanalys av SVZ celler odlas som neurosfärer.

Protocol

OBS: Alla djurförsök i detta protokoll genomförs med godkännande av University of Florida Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) och är i överensstämmelse med "Guide för skötsel och användning av försöksdjur. 1. Grund Experimental Ställ in Innan Intermittent Hypoxi Administration Exponera valpar 12 till de olika gasblandningar med hjälp av en hela kroppen mus pletysmograf kammare på ungefär samma sätt som vuxna gnagare på and…

Representative Results

De initiala experiment, baserat på historiska data, genomfördes med hjälp av en min cykellängder. Baserat på de efterföljande kalibreringar som gjorts i steg 2 ovan bestämdes att O 2-nivå i kammaren var 13% vid 1 min efter hypoxi spolning och att det tog en liknande tid att återgå till baslinjen 21%. Det var en 2 min cykel är tillräcklig för att både uppnå 10% syre och en återgång till 21% under "baseline" cykel. Därefter har två min cykellängder använts. Protokollet varaktighet…

Discussion

This work reports the development of a protocol to expose neonatal rodents to AIH. The parameters described here effectively alter in situ neural stem cell biology, which is observable over several rounds of cell passage. Specifically, AIH increases the number of non-adherent neurospheres, the expansion of cells within each neurosphere (refected by sphere diameter), the expansion of adherent NPC populations, and the presence of neuroblasts in both non-adherent and adherent populations. It should be emph…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Mouse plethysmography chambers	Buxco	PLY4211
Flow meter	Porter	F150
Bias flow unit	AFPS
Baseline Gas Mix	Airgas	AIZ300	Compressed Air
Hypoxic Gas Mix	Airgas	X03NI72C2000189	10% Oxygen, balance nitrogen
Oxygen Meter	Teledyne	AX-300